C57BL-6小鼠乙型肝炎病毒感染模型中細(xì)胞因子研究.pdf

1、背景與目的：
　　 建立C57BL/6 小鼠乙型肝炎病毒HBV 感染的動物模型，參考基因芯片結(jié)果，檢測模型肝組織中趨化因子IL-18、Mig、IP-10、CXCL12、CCR7、CCL19 及部分急性期蛋白基因、免疫相關(guān)蛋白的基因表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究炎性因子在HBV 感染中作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1．建立C57BL/6 小鼠HBV 感染的動物模型：pBluescript-HBV 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

2、超級感受態(tài)細(xì)菌DH5α，提取大量質(zhì)粒，高壓水動力法于小鼠尾靜脈注射，建立感染模型，同時設(shè)立空載對照組（pBluescript）動物模型。
　　 2．建模第4天取模型動物外周血，ELISA 試劑盒檢測外周血中HBsAg的表達(dá)水平，驗(yàn)證感染模型是否成功建立，收取肝組織凍存。
　　 3．參考基因芯片檢測結(jié)果，挑選感興趣的差異表達(dá)趨化因子，設(shè)計引物。Trizol 法提取肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，Real-time PCR

3、檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組對應(yīng)因子的基因拷貝數(shù)量，RT-PCR凝膠電泳分析。
　　 4．免疫組織化學(xué)法對表達(dá)差異較明顯的因子IP-10 進(jìn)行檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1．HBV 感染C57BL/6 小鼠模型的建立：ELISA 檢測尾靜脈高壓注射HBVC57BL/6 小鼠組HBsAg 結(jié)果為陽性，表明通過尾靜脈高壓注射HBV 感染C57BL/6 小鼠模型建立成功。
　　 2．HBV 感染C57BL/6 小鼠模型肝

4、組織趨化因子的表達(dá)：①Real-time PCR檢測結(jié)果表明，擴(kuò)增曲線和溶解曲線良好，實(shí)驗(yàn)組與空載對照組相比，IL-18，Mig，IP-10，Cxcl12，Ccl19，Ccr7的表達(dá)均有不同程度的增高，以IP-10 最為顯著；RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳可見特異引物擴(kuò)增的條帶，IP-10 相應(yīng)條帶最為明顯，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組中上述趨化因子基因拷貝數(shù)有不同程度增加，與Real-timePCR檢測結(jié)果呈一致趨勢；②免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)果表明，

5、實(shí)驗(yàn)組IP-10表達(dá)增加。
　　 3．HBV 感染C57BL/6 小鼠模型肝組織免疫應(yīng)答分子和急性蛋白分子的表達(dá)：Real-time PCR結(jié)果表明，擴(kuò)增曲線和溶解曲線良好，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中急性期應(yīng)答相關(guān)分子Saa2表達(dá)增高；RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組中熱休克蛋白相關(guān)基因Dnajc10、急性期應(yīng)答相關(guān)因子Saa2、固有免疫應(yīng)答分子Masp1、以及抗凋亡因子Vnn1的表達(dá)均有不同程度增加。
　　

6、結(jié)論：
　　 依據(jù)ELISA 檢測HBsAg 結(jié)果表明，HBV 感染C57BL/6 小鼠動物模型建立成功。Real-time PCR和RT-PCR均顯示趨化因子IL-18、Mig、IP-10、Cxcl12、Ccl19、Ccr7在實(shí)驗(yàn)組有不同程度的增高；PCR結(jié)果與免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果均表明IP-10 因子表達(dá)增加明顯，提示HBV 感染中趨化因子的表達(dá)不同程度增加，以及免疫應(yīng)答相關(guān)分子的表達(dá)均有不同程度的表達(dá)增加，其表達(dá)增高作用及