雷公藤甲素治療大數(shù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍組織慢性炎癥病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的自身免疫性疾病，是臨床多發(fā)病。
　　 RA發(fā)病特點(diǎn)是反復(fù)發(fā)作，病情纏綿，且有較高的致殘率，嚴(yán)重危害人類健康。近年來雖在RA發(fā)病機(jī)制及病理變化等研究領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展，但是長期應(yīng)用西藥治療，毒副作用大，療效不佳。中醫(yī)藥治療具有療效較好、毒副作用小的特點(diǎn)。因而，利用豐富的中醫(yī)藥資源，開發(fā)治療RA有效的方法和藥物，明確其治

2、療機(jī)制，有重要的科學(xué)意義和社會意義。
　　 RA屬于中醫(yī)頑痹范疇，其病因?yàn)橥飧泻疂裰埃瑲庋庩柺д{(diào)，臟腑虧損，寒濕凝滯，氣血運(yùn)行不暢導(dǎo)致邪盛正虛、瘀滯挾雜引起關(guān)節(jié)腫脹、疼痛變形、晨僵等癥狀。中醫(yī)認(rèn)為，氣行則血行，氣滯則血凝，不通則痛，通則不痛。人體正氣的強(qiáng)弱，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的演變和預(yù)后起著重要作用。故治療原則應(yīng)以整體出發(fā)，針對病因病機(jī)，扶正祛邪，寒熱并用，以祛風(fēng)除濕，通絡(luò)散寒，扶正固本為基本治法。而對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效最為突出

3、的中藥首推雷公藤(TriPteyrgimu Wilofulii Hook F,TWHF)。
　　 雷公藤系衛(wèi)矛科雷公藤屬木質(zhì)藤本植物，最早記載雷公藤功效的是公元1476年明朝蘭茂所著的滇南本草，書中稱其味辛，性溫，有毒，入肝脾十二經(jīng)，行十二經(jīng)絡(luò)，具有治筋骨疼痛，風(fēng)寒濕痹，麻木不仁，癱瘓痿軟，濕氣流痰等功效，能緩解肢體的疼痛與拘攣等癥狀。雷公藤作為一種傳統(tǒng)中藥，具有活血化瘀、清熱解毒、消腫散結(jié)、殺蟲止血等功效，可以起到扶正以御邪氣

4、之作用，使RA之邪、虛、瘀得以治療，直中病機(jī)。
　　 雷公藤作為一種新的免疫抑制劑應(yīng)用于臨床已有近30年。其中，環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物—雷公藤甲素(triptolide，TP)被認(rèn)為是最主要的抗炎和免疫抑制成分。藥理和臨床試驗(yàn)表明其具有免疫抑制、抗炎等多種生物活性，為常用的改善病情類抗風(fēng)濕藥，能緩解RA骨侵蝕，是治療RA的有效藥物。
　　 大量的臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TP具有較好的抗炎作用，特別是對RA有很好的療效。TP治療RA(R

5、A)起效時(shí)間較快(平均2.57d)，用藥后能明顯減輕關(guān)節(jié)腫痛，改善關(guān)節(jié)功能障礙，降低血沉，控制發(fā)熱，并能部分或全部代替激素和/或非甾體抗炎藥物，且較之為優(yōu)(近期有效率達(dá)100％，顯效率為46.67％)。TP在劑量范圍0.05-0.3mg/kg時(shí)，無論是皮下注射、腹腔注射還是灌胃均能明顯抑制大鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加，對角叉菜膠性和甲醛性前足腫脹具有明顯的抑制作用，表明藥物對滲出性和增殖性炎癥均有療效。
　　 RA主要病理特點(diǎn)是滑

6、膜細(xì)胞增生，襯里層增厚，多種炎性細(xì)胞浸潤，血管翳形成，以及軟骨和骨組織的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。
　　 大量資料表明T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和增生的滑膜細(xì)胞在這種疾病的發(fā)病機(jī)制中起主要作用，其中滑膜成纖維細(xì)(Fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)表型改變的機(jī)制成為RA發(fā)生機(jī)制研究的新熱點(diǎn)。
　　 現(xiàn)在已有大量的證據(jù)提示，F(xiàn)LS是RA的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，它們釋放多種效應(yīng)分子作用于各種細(xì)胞(淋巴細(xì)

7、胞、單核細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞)，降解細(xì)胞外基質(zhì)并且向間充質(zhì)細(xì)胞和浸潤免疫細(xì)胞提供趨化和活化信號。抑制FLS效應(yīng)的治療策略可以顯著地減輕關(guān)節(jié)炎和預(yù)防骨的吸收。
　　 因此，TP治療RA療效確切。然而，TP治療RA的機(jī)制仍舊處于起步階段，詳細(xì)作用機(jī)制仍需深入探討。其中，TP抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖機(jī)制研究很少。在本研究中，我們對TP抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖作用進(jìn)行驗(yàn)證并利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較RA滑膜成纖維細(xì)胞受到TP刺激后發(fā)生上調(diào)或

8、下調(diào)的蛋白質(zhì)，這將有利于揭示TP抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，將有助于為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，并有利于理解RA發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為其臨床治療提供候選靶點(diǎn)。
　　 本課題采用的具體研究方案如下:
　　 (1)制作RA大鼠模型。
　　 本課題采用新的模型制作方法，熱殺死結(jié)核桿菌(Heat-killed myeobaeterium tuberculosis H37Ra，Mtb)誘導(dǎo)建立大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，該模型

9、造模成功率高(可達(dá)100％)，關(guān)節(jié)炎癥發(fā)生時(shí)間早(注射Mtb后8天左右發(fā)生，15天達(dá)高峰)，實(shí)驗(yàn)周期較短，是較為理想的研究藥物治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效及其作用機(jī)理的模型。
　　 (2)研究TP對RA有關(guān)指標(biāo)的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為3組:空白對照組、模型對照組、TP組。采用HE染色法進(jìn)行滑膜組織病理學(xué)檢查，觀察RA程度;在前期的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步應(yīng)用LiquiChip蛋白液相芯片系統(tǒng)檢測RA的多種相關(guān)因子TGF、IGF-1、I

10、FN-γ、TNF-α、MCP-1、MIP-2、IL-1、IL-4、IL-6、IL-12、IL-13、IL-17、VCAM-1、ICAM-1等含量變化。
　　 (3)研究類風(fēng)濕發(fā)生過程中的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。
　　 取上述實(shí)驗(yàn)各組的動物組織，提取總蛋白，應(yīng)用蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳技術(shù)(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)、質(zhì)譜儀等蛋白組學(xué)相關(guān)技術(shù)和方法，篩選差異蛋白表達(dá)譜，然后應(yīng)用免疫組化、We

11、stern Blot、Q-PCR等方法鑒定關(guān)鍵蛋白質(zhì)，進(jìn)一步弄清RA發(fā)生過程中的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。
　　 本課題結(jié)果表明:
　　 (1)TP治療后，RA大鼠病變關(guān)節(jié)腫脹有顯著的消退。
　　 (2)TP治療后，RA大鼠細(xì)胞因子譜發(fā)生變化:模型組IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-1α血清水平明顯升高，而TP治療后顯著下降，模型組血清IL-4、IL-10顯著升高，而TP治療組相對于模型組顯著升高。
　　 (

12、3)經(jīng)過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選得到同時(shí)滿足下列條件的差異點(diǎn)5個(gè):1)模型組與正常對照組之間存在差異;2)TP治療組上述1)差異點(diǎn)變化趨勢逆轉(zhuǎn);3)變化趨勢1.5倍以上。差異點(diǎn)分別為:AnnexinA3、Cytoplasmic aconitate hydratase、Peroxiredoxin 6、Transgelin、LIM and SH3 domain protein 1。
　　 (4)經(jīng)過Q-PCR、western-blot對

13、感興趣的蛋白質(zhì)(Peroxiredoxin 6、Transgelin)進(jìn)行驗(yàn)證，表明其表達(dá)水平的變化與蛋白質(zhì)組學(xué)分析一致。
　　 Annexin A3也被稱作lipocortin 3或placental anticoagulant protein 3是膜聯(lián)蛋白(annexin)家族的一員。
　　 Annexin家族是Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，是細(xì)胞內(nèi)高豐度蛋白，約占細(xì)胞總蛋白的1％～2％;annexin是一種普遍存在的

14、細(xì)胞溶質(zhì)蛋白，其以可溶形式和以通過與細(xì)胞骨架組成蛋白或調(diào)控細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用蛋白的穩(wěn)定結(jié)合或可逆結(jié)合的形式存在。Annexin家族包括A，B，C，D和E5類，脊椎(哺乳)動物的annexin屬A類，被報(bào)道的有12種(annexinA1-A11和A13);無脊椎動物的屬B類;真菌和部分單細(xì)胞真核生物的屬C類;植物的annexin屬于D類;原核生物的annexin則屬于E類。Annexin家族成員參與抗凝血、抗炎、出胞入胞作用、信號轉(zhuǎn)

15、導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生理活動。
　　 Annexin表達(dá)失調(diào)與人類疾病相關(guān)，其表達(dá)水平的改變或其定位的改變可引起病態(tài)或產(chǎn)生疾病。Annexin在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，可介導(dǎo)細(xì)胞信號通路、細(xì)胞運(yùn)動、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、細(xì)胞凋亡及抗藥性。
　　 我們推測:Annexin A3可能在RA關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞表達(dá)釋放細(xì)胞因子、MMP等方面發(fā)揮作用，導(dǎo)致滑膜細(xì)胞增殖、侵襲能力增加等。
　　 Transgelin是一種未

16、知功能的22 kDa蛋白質(zhì)，也被命名為SM22。該蛋白質(zhì)曾在多種樣本中被鑒別出，并在鼠p27、WS3-10、膠轉(zhuǎn)蛋白和SM22的一些不同命名下對其進(jìn)行了研究。物種間的基因和蛋白質(zhì)序列高度保守，且在果蠅和秀麗隱桿線蟲中鑒別出同源性。膠轉(zhuǎn)蛋白是肌動結(jié)合蛋白鈣調(diào)蛋白家族中的一種，存在于細(xì)胞骨架中。
　　 Transgelin是一種肌動蛋白壓力纖維素相關(guān)的蛋白質(zhì)，與凝膠劑起反應(yīng)并能穩(wěn)定體外的肌動蛋白凝膠劑。它還與平滑肌中的激動蛋白絲有相

17、關(guān)性?？紤]到膠轉(zhuǎn)蛋白是一種最早的平滑肌細(xì)胞分化標(biāo)志物且其與肌動蛋白有關(guān)，很久之前就假設(shè)它有調(diào)節(jié)這些細(xì)胞發(fā)育和收縮的功能。但是，無膠轉(zhuǎn)蛋白(SM22-/-)的小鼠能正常發(fā)育、繁殖，且沒有出現(xiàn)血壓、心率、組織學(xué)或組織形態(tài)學(xué)上的任何改變。不過，對無膠轉(zhuǎn)蛋白小鼠血管平滑肌的進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)小鼠對興奮劑誘導(dǎo)的、鈣獨(dú)立收縮的收縮性反應(yīng)度增加。膠轉(zhuǎn)蛋白可能也涉及到細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。膠轉(zhuǎn)蛋白也可能與細(xì)胞的移動有關(guān)。已證明其與肌動蛋白絲束的一種特異性亞群有關(guān)聯(lián)，

18、而肌動蛋白絲束足體會形成足體。該事實(shí)表明鈣調(diào)蛋白的缺失能引起鈣調(diào)蛋白與膠轉(zhuǎn)蛋白轉(zhuǎn)化率的降低，從而有利于足體的形成并致使細(xì)胞向侵略性、惡性細(xì)胞方向發(fā)展。
　　 最近的證據(jù)表明某些細(xì)胞中的腫瘤抑制功能與膠轉(zhuǎn)蛋白有關(guān)，而與細(xì)胞骨架本身沒有關(guān)系。在前列腺腫瘤細(xì)胞中，已顯示膠轉(zhuǎn)蛋白能通過阻止雄性激素受體聯(lián)合活化劑與雄性激素受體的結(jié)合來抑制雄性激素所刺激的細(xì)胞生長，以及隨后向細(xì)胞核的移位。膠轉(zhuǎn)蛋白也有抑制間質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9表達(dá)的作用。

19、MMP-9涉及到組織的重組過程，而組織的重組導(dǎo)致癌癥細(xì)胞的移動和對周圍組織的侵犯。
　　 由于我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明膠轉(zhuǎn)蛋白在TP治療RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中表達(dá)發(fā)生改變，而膠轉(zhuǎn)蛋白可能與MMP-9的表達(dá)相關(guān)，因此，我們推測TP作用于關(guān)節(jié)滑膜組織，可能影響轉(zhuǎn)膠蛋白表達(dá)，通過影響MMP-9表達(dá)，而發(fā)揮抑制骨質(zhì)破壞的作用。
　　 總結(jié):通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，我們找到一些可能參與TP治療RA的蛋白質(zhì)，一些蛋白目前已有文獻(xiàn)報(bào)道與RA發(fā)生