帕金森病鐵代謝異常的腦區(qū)差異和細(xì)胞易感性差異研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease，PD)是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，僅次于阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)。臨床表現(xiàn)主要包括靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌僵直和姿勢(shì)步態(tài)障礙等運(yùn)動(dòng)癥狀，同時(shí)患者可伴有抑郁和睡眠障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀。其主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)(substantia nigra, SN)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的變性死亡，由此而引起的紋狀體DA含量顯著性減少。目前，PD的

2、確切病因仍不清楚，包括遺傳因素和非遺傳因素。非遺傳因素中，氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥、蛋白異常聚集、凋亡、鐵的過(guò)度沉積等均可能參與了PD多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡過(guò)程。在這些病因中，鐵的異常聚集越來(lái)越受到研究人員的關(guān)注，之前大多研究都把焦點(diǎn)放到了黑質(zhì)本身，很少關(guān)注其他腦區(qū)的鐵代謝情況。而黑質(zhì)過(guò)多的鐵究竟來(lái)源于哪里？是否來(lái)源于其他腦區(qū)？本研究在正常人和PD病人死后的腦組織中，應(yīng)用ICP方法，測(cè)定了大腦顳葉皮層鐵、錳、鎳和銅四種過(guò)渡金屬元

3、素的含量，并且應(yīng)用免疫印記法觀察了該腦區(qū)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(divalent metal transporter1，DMTl)，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體-1(transferrin receptor1，TfRl)和鐵轉(zhuǎn)出蛋白ferroportin1(FPN1)的表達(dá)變化，同時(shí)觀察了其共同的調(diào)節(jié)蛋白鐵調(diào)節(jié)蛋白（iron regulatory protein1，IRP1）的變化。同時(shí)應(yīng)用AD腦組織標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。
　　

4、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是一種誘導(dǎo)型應(yīng)激反應(yīng)蛋白。尸檢結(jié)果證實(shí)，PD病人SN區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和Lewy小體中HO-1水平較正常人明顯增高，提示HO-1在PD病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。HO-1能夠分解血紅素生成游離的鐵，一氧化碳和膽綠素。后兩者在體內(nèi)有強(qiáng)的還原活性而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用，而游離鐵可能通過(guò)Fenton反應(yīng)加重氧化應(yīng)激損傷。目前的研究多集中于HO-1表達(dá)調(diào)控對(duì)細(xì)胞的保護(hù)性作用，而HO-1在這

5、兩種細(xì)胞中的表達(dá)方式及作用是否有差異，其是否參與了PD中神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的不同易感性沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用原代細(xì)胞培養(yǎng)、免疫印跡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦掃描技術(shù)等多項(xiàng)研究方法，觀察了神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+）和α-突觸核蛋白處理后，腹側(cè)中腦(ventralmesencephalon，VM)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞HO-1時(shí)間依賴(lài)性表達(dá)以及HO-1活性改變后兩種

6、細(xì)胞對(duì)神經(jīng)毒素的易感性，即線粒體跨膜電位差(Mitochondiralmembrane potential，ΔΨm)的變化。研究結(jié)果如下:
　　 1、PD組顳葉皮層Fe含量為110.30±3.98 ng/mg，較正常對(duì)照組(131.25±7.37ng/mg)相比明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。AD組無(wú)明顯變化。Mn、Ni和Cu的含量，PD組和AD組較正常組均無(wú)明顯變化。
　　 2、PD組顳葉皮層DMT1、Tf

7、R1、FPN1、IRP1蛋白表達(dá)水平均明顯降低，與正常對(duì)照組相比，分別降低22.22％、14.23％、21.11％和36.9％。差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。AD組無(wú)明顯變化。
　　 3、100μMMPP+處理體外培養(yǎng)的VM神經(jīng)元1h、4h、12h、24 h，HO-1蛋白表達(dá)水平于24 h時(shí)開(kāi)始升高。5μg/mlα-突觸核蛋白處理30 min、2h、4h、12h、24 h、48 h，HO-1表達(dá)水平于12h時(shí)開(kāi)始升高，且于2

8、4 h到達(dá)峰值，48 h下降。
　　 4、100μM MPP+或5μg/mlα-突觸核蛋白處理體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞30min、1h、2h、4h、8h、12h、24 h，HO-1表達(dá)水平于1h時(shí)開(kāi)始升高，并于12h到達(dá)高峰。
　　 5、100μM MPP+處理VM神經(jīng)元4h或5μg/mlα-突觸核蛋白處理VM神經(jīng)元1h，細(xì)胞的ΔΨm明顯降低，較正常對(duì)照組相比，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 or0.01)。應(yīng)用HO-1

9、激活劑原卟啉Ⅸ氯化鈷(protoporphyrinⅨ cobalt chloride，Copp)(5μM)預(yù)處理24 h，可阻斷由MPP+或α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的ΔΨm的降低，而HO-1抑制劑原卟啉Ⅸ鋅(protoporphyrinⅨzinc，Znpp)（5μM）預(yù)孵育對(duì)MPP+或α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的ΔΨm的變化沒(méi)有影響，但可完全阻斷Copp的作用。
　　 6、100μM MPP+處理VM星形膠質(zhì)細(xì)胞4h或5μg/mlα-突觸核蛋

10、白處理1h，ΔΨm較正常對(duì)照組相比均明顯降低;與5μM Copp預(yù)處理24h后，MPP+或α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的ΔΨm下降可恢復(fù)至接近正常水平;5μM Znpp共孵育使MPP+或α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的ΔΨm降低更加明顯，且可完全阻斷Copp對(duì)MPP+或α-突觸核蛋白的保護(hù)作用。
　　 7、100μM MPP+或5μg/mlα-突觸核蛋白處理VM神經(jīng)元24 h，ΔΨm較正常對(duì)照組相比均明顯降低;5μM Copp預(yù)處理24h后，MPP+

11、誘導(dǎo)的ΔΨm降低更加明顯，但可以輕微阻斷α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的ΔΨm降低;5μM Znpp共孵育使MPP+或α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的ΔΨm降低更加明顯，但可完全阻斷Copp的上述作用。
　　 8、100μM MPP+或5μg/mlα-突觸核蛋白處理VM星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h，ΔΨm較正常對(duì)照組相比均明顯降低;MPP+或α-突觸核蛋白與Copp共孵育24 h，VM星形膠質(zhì)細(xì)胞ΔΨm恢復(fù)至正常水平;5μM Znpp共孵育使MPP+或α-突觸

12、核蛋白誘導(dǎo)的ΔΨm降低更加明顯，但可完全阻斷Copp對(duì)MPP+或α-突觸核蛋白的保護(hù)作用。
　　 9、100μM的MPP+或5μg/ml的α-突觸核蛋白處理VM星形膠質(zhì)細(xì)胞12h，ΔΨm較正常對(duì)照組相比明顯降低;1μMCopp共孵育12 h，可部分阻斷MPP+或α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的ΔΨm下降;5μM Copp共孵育12h，ΔΨm恢復(fù)至接近正常水平。
　　 10、10μM和25μM的Copp處理VM神經(jīng)元48 h，內(nèi)源性α

13、-突觸核蛋白水平較正常對(duì)照組相比均明顯降低，且25μM組較10μM組相比降低更加明顯。
　　 上述結(jié)果表明，PD病人大腦皮層顳葉鐵水平存在異常，且可能與鐵代謝相關(guān)蛋白的異常表達(dá)有關(guān);MPP+和α-突觸核蛋白均可誘導(dǎo)VM神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中HO-1的表達(dá)上調(diào)，但星形膠質(zhì)細(xì)胞HO-1的上調(diào)明顯早于神經(jīng)元。MPP+和α-突觸核蛋白均可誘導(dǎo)VM神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中ΔΨm的下降。抑制HO-1可加重MPP+和α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的線粒體損

14、傷。激活HO-1對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞始終具有線粒體功能的保護(hù)性作用，而HO-1的過(guò)量表達(dá)可加重神經(jīng)元的損傷。神經(jīng)元HO-1表達(dá)上調(diào)會(huì)降解內(nèi)源性α-突觸核蛋白。本研究首次證實(shí)PD病人顳葉鐵及鐵代謝相關(guān)蛋白水平存在異常，并作出顳葉和主要病變區(qū)-黑質(zhì)之間存在鐵的重新分布這一假設(shè)，為黑質(zhì)區(qū)異常聚集鐵的來(lái)源研究提供了一個(gè)可能的病理途徑。另外，對(duì)于細(xì)胞易感性的探討證實(shí)，神經(jīng)毒素MPP+和旺-突觸核蛋白誘導(dǎo)的HO-1上調(diào)在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中具有保護(hù)作