Sirt1對豬肌內(nèi)脂肪前體細胞分化的影響及其機制初步研究.pdf

1、肌內(nèi)脂肪是決定豬肉品質(zhì)和風味的重要因素，如何調(diào)控豬肌內(nèi)脂肪沉積進而改善豬肉品質(zhì)是目前畜牧業(yè)面臨的關(guān)鍵科學問題之一。Sirt1是重要的細胞增殖分化因子，在脂肪細胞分化和脂肪代謝中具有重要作用。本研究以豬肌內(nèi)脂肪細胞為試驗對象，利用Sirt1激動劑、抑制劑及RNA干擾技術(shù)和超表達技術(shù)探究Sirt1對豬肌內(nèi)脂肪前體細胞分化和肌內(nèi)脂肪細胞脂肪分解的影響，進一步通過基因芯片技術(shù)篩選肌內(nèi)脂肪前體細胞中Sirt1調(diào)控基因。主要研究結(jié)果如下:
　

2、　1.豬肌內(nèi)脂肪前體細胞的分離、鑒定及Sirt1超表達載體的構(gòu)建選取3頭5-7日齡仔豬，取背最長肌，利用差速貼壁法獲得豬肌內(nèi)脂肪前體細胞。結(jié)果顯示:分離得到的細胞形態(tài)正常。誘導(dǎo)培養(yǎng)后，油紅O染色、BODIPY染色結(jié)果表明細胞中有脂滴出現(xiàn)。PCR鑒定結(jié)果表明，脂肪前體細胞標志基因PPARγ、 LPL、CEBPβ在細胞中均有表達。提示:豬肌內(nèi)脂肪前體細胞分離成功。同時，構(gòu)建了Sirt1超表達載體，將合成的Sirt1全長基因和pcDNA3.1

3、(+)表達載體進行雙酶切，利用T4連接酶將酶切后的目的基因和表達載體進行連接，雙酶切和測序結(jié)果表明，Sirt1超表達載體構(gòu)建成功。
　　2.Sirt1對豬肌內(nèi)脂肪前體細胞分化及肌內(nèi)脂肪細胞脂肪分解的影響在肌內(nèi)脂肪前體細胞中，50μM、100μM、200μM Sirt1抑制劑NAM處理細胞24小時，均不同程度抑制Sirt1 mRNA表達，細胞分化相關(guān)基因PPARγ、脂肪分解相關(guān)基因ATGL、HSL mRNA表達降低;同時，50μM、

4、100μM Sirt1激動劑RES處理細胞24小時，50μM RES處理組與對照組基因表達差異不顯著，100μM RES顯著促進Sirt1 mRNA表達，細胞分化相關(guān)基因PPARγ、脂肪分解相關(guān)基因ATGL、HSL mRNA表達升高。進一步利用Sirt1干擾載體轉(zhuǎn)染細胞，處理24小時后，Sirt1 mRNA表達顯著降低(P＜0.01)，同時抑制PPARγ、ATGL、HSL mRNA表達(P＜0.01);Sirt1超表達載體轉(zhuǎn)染細胞24小

5、時后，Sirt1 mRNA表達顯著升高(P＜0.01)，同時促進PPARγ、ATGL、HSL mRNA表達(P＜0.01)。在成熟的肌內(nèi)脂肪細胞中，100μM NAM處理細胞24小時，抑制Sirt1 mRNA表達(P＜0.05)，PPARγ、ATGL、HSL mRNA表達降低(P＜0.05)。100μM RES處理細胞24小時，促進Sirt1 mRNA表達(P＜0.01)，PPARγ、ATGL、HSL mRNA表達升高(P＜0.05)。

6、以上結(jié)果提示:Sirt1可以通過調(diào)控脂肪代謝因子PPARγ等的基因表達促進肌內(nèi)脂肪前體細胞分化和肌內(nèi)脂肪細胞脂肪分解。
　　3.篩選肌內(nèi)脂肪前體細胞中Sirt1調(diào)控基因首先，用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sirt1干擾載體和超表達載體的細胞。利用Real-time PCR和Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的Sirt1 mRNA和蛋白表達水平。與陰性對照相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sirt1干擾載體的細胞，Sirt1 mRNA表達顯著降低(P＜0

7、.01);與陰性對照相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sirt1超表達載體的細胞，Sirt1 mRNA表達和蛋白水平顯著升高（P＜0.01）。提示:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞篩選成功。在此基礎(chǔ)上，利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sirt1干擾載體和陰性對照載體的細胞進行基因芯片分析，篩選得到差異表達2倍以上基因共154個，表達量升高基因76個，表達量降低基因78個，并且篩選得到PPAR通路及相關(guān)基因FABP3、LPL和SCD1，轉(zhuǎn)染Sirt1干擾載體后，F(xiàn)ABP3、LPL和SCD1基因表達

8、顯著降低(P＜0.01)，抑制脂肪細胞分化。同時，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sirt1超表達載體和陰性對照載體的細胞進行基因芯片分析，篩選出差異表達2倍以上基因共84個，表達量升高基因24個，表達量降低基因60個。并且，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sirt1超表達載體后，F(xiàn)ABP3、aP2和SCD1等基因顯著升高（P＜0.05）。提示:Sirt1可能通過調(diào)控PPAR信號通路中基因的表達影響肌內(nèi)脂肪前體細胞分化。
　　綜上所述:在豬肌內(nèi)脂肪前體細胞和肌內(nèi)脂肪細胞中，Si