皮膚創(chuàng)面愈合過程中MC1R表達(dá)陽性細(xì)胞動態(tài)變化.pdf

1、背景：皮膚為身體重要的大型器官，其暴露于體表，因此是最容易受到損害的。根據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國每年僅燒傷病人就有500至1000萬人。僅有少數(shù)人創(chuàng)面易于愈合，大部分人創(chuàng)面難愈合或形成嚴(yán)重瘢痕，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。目前，對于創(chuàng)面愈合大多數(shù)方法是促進(jìn)創(chuàng)面愈合速率，沒有從再生醫(yī)學(xué)角度研究，促使組織再生達(dá)到功能性修復(fù)。皮膚中干細(xì)胞是組織再生修復(fù)的關(guān)鍵，而干細(xì)胞動員、增殖、遷移、分化的確切機(jī)制尚不十分清楚。根據(jù)我們前期研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)α-促黑素及受體高表達(dá)

2、于干細(xì)胞富集區(qū)域，且MSH/MC1R在創(chuàng)面愈合中的時空表達(dá)特性有相似之處。那么MC1R是否表達(dá)于皮膚表皮干細(xì)胞及是否分泌α-MSH，從而調(diào)控表皮干細(xì)胞增殖、遷移和分化，進(jìn)而促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合呢？本研究為探討這一問題展開，借此為探尋表皮干細(xì)胞在創(chuàng)面修復(fù)過程中的作用及其調(diào)控機(jī)制提供新的思路。
　　方法：本次研究分為體內(nèi)、體外試驗(yàn)，從基因水平、蛋白水平、定性、定位、定量不同角度開展。
　　1.體外試驗(yàn)：（1）分離與培養(yǎng)出生一天大鼠

3、皮膚中表皮干細(xì)胞，通過細(xì)胞免疫熒光方法將表皮干細(xì)胞干性標(biāo)志K19、β1Integrin與MC1R共染細(xì)胞原位表達(dá)鑒定表皮干細(xì)胞是否表達(dá)MC1R；（2）將培養(yǎng)大鼠表皮干細(xì)胞裂解提取細(xì)胞總RNA，并利用RT-PCR及擴(kuò)增產(chǎn)物測序方法在基因水平檢測表皮干細(xì)胞是否表達(dá)MC1R及α-MSH。
　　2.體內(nèi)試驗(yàn)：選擇6-8周清潔級健康SD雄性大鼠，制作大鼠背部皮膚創(chuàng)傷模型，分別于1、3、5、7、14、21天處死大鼠后切取圓形創(chuàng)面及周邊2mm正

4、常皮膚，將取下皮膚對半分開。一半立即液氮速凍碾碎提取皮膚總 RNA，使用定量PCR技術(shù)在基因水平定量檢測大鼠創(chuàng)面愈合過程中MC1R、干性基因K19、β1Integrin的動態(tài)變化。另一半創(chuàng)面皮膚組織多聚甲醛固定后石蠟包埋，切片進(jìn)行 HE染色和免疫組織化學(xué)染色在大鼠皮膚中原位表達(dá)檢測創(chuàng)面愈合過程中MC1R表達(dá)陽性細(xì)胞的動態(tài)變化。以及組織免疫熒光方法原位檢測皮膚中干細(xì)胞是否表達(dá)MC1R。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果示：

5、大鼠表皮干細(xì)胞干性基因K19、β1Integrin與MC1R共染都在同一部位有陽性信號。RT-PCR檢測表皮干細(xì)胞在基因水平表達(dá)MC1R、POMC、PC1、PC2、7B2。并將擴(kuò)增產(chǎn)物測序后在Pubmed中與原基因序列比對重合率達(dá)99％。
　　2.大鼠創(chuàng)面皮膚HE染色示：皮膚創(chuàng)面愈合經(jīng)歷了止血期、炎癥反應(yīng)期、細(xì)胞增殖期、組織重塑期。與之相對應(yīng)進(jìn)行 MC1R免疫組化染色觀察到在不同愈合期時間點(diǎn) MC1R表達(dá)部位不同。創(chuàng)傷后第一天，處

6、于炎癥反應(yīng)期，炎性細(xì)胞遷移聚集到傷口邊緣，MC1R表達(dá)于傷口邊緣基底層細(xì)胞、炎性細(xì)胞及周圍正常皮膚毛囊中，而在正常皮膚皮膚基底層中沒有檢測到陽性信號；隨著創(chuàng)面愈合第3天開始處于細(xì)胞增殖期，HE染色明顯觀察到皮膚基底層細(xì)胞向傷口聚集遷移的趨勢，而在免疫組織化學(xué)染色中可見到這些在創(chuàng)面邊緣聚集遷移的細(xì)胞表達(dá)MC1R呈現(xiàn)強(qiáng)陽性信號，并且隨著創(chuàng)面愈合，這些細(xì)胞不斷延生形成皮膚新的基底層。直至創(chuàng)面愈合14天、21天，可觀察到創(chuàng)面完全封閉，新生成表皮

7、完全連接兩側(cè)正常皮膚。MC1R在新基底層中無陽性信號，只在正常皮膚毛囊中檢測到。
　　3.皮膚免疫熒光共染色技術(shù)在皮膚中原位檢測表皮干細(xì)胞是否表達(dá)MC1R。結(jié)果可知：在表皮干細(xì)胞表達(dá)干性基因 K19顯示為綠色信號，MC1R為紅色信號，二者在同一部位細(xì)胞能夠重合。
　　4.從定量PCR結(jié)果獲知，大鼠創(chuàng)面愈合過程中，MC1R、干性基因K19、β1Integrin均呈現(xiàn)拋物線變化。愈合第三天開始表達(dá)量逐漸增高，到皮膚創(chuàng)面基本愈合時

8、候表達(dá)量逐漸降低至正常水平。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠分離培養(yǎng)及皮膚組織體內(nèi)原位表皮干細(xì)胞表達(dá)MC1R，但是介于表皮干細(xì)胞無特異性的標(biāo)志物，因此還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)使用更多的干性標(biāo)志物與MC1R共染，及采用不同的試驗(yàn)方法從不同角度驗(yàn)證。
　　2.皮膚創(chuàng)面愈合過程中，MC1R表達(dá)部位變化說明其參與了創(chuàng)面愈合過程，并且與干細(xì)胞參與創(chuàng)面愈合過程有共同變化趨勢。但是在皮膚愈合中表達(dá)MC1R陽性細(xì)胞是否是干細(xì)胞及動態(tài)遷移過程并不清楚，