Crizotinib對肺癌LLC細胞“主側(cè)群”的抑制作用及其機制.pdf

1、肺癌是一種發(fā)病率、死亡率極高的惡性腫瘤。基于2008年GLOBOCAN統(tǒng)計，在男性患者中，肺癌的發(fā)病率居首。肺癌新發(fā)病例占新發(fā)癌癥總數(shù)的17％，其死亡患者占癌癥死亡總數(shù)的23％。同時發(fā)展中國家對于女性肺癌患者的負擔高達宮頸癌的負擔。隨著對干細胞和腫瘤生物學研究的深入，人們觀察到腫瘤中有一小群具有自我更新和再生腫瘤能力的細胞，被稱為腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)。目前研究認為CSC是引起臨床上化療失敗、腫瘤復(fù)發(fā)和遠

2、處轉(zhuǎn)移的主要原因。研究CSC首要步驟是分離“側(cè)群”(side population，SP)細胞。進一步研究顯示SP細胞有自我更新、無限增殖能力及強致瘤性，具有腫瘤干細胞的特性。
　　近年分子靶向治療越來越受到人們的關(guān)注。Crizotinib(PF-02341066)是一種以ALK和c-Met為靶點的小分子口服藥。2011年8月，Crizotinib被美國FDA批準用于臨床治療ALK陽性的非小細胞肺癌。本研究通過研究Crizotin

3、ib對路易士肺癌(lewis lung cancer，LLC)細胞株“主側(cè)群”的治療作用，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　材料與方法：
　　1、分離及鑒定肺癌細胞系LLC“主側(cè)群”細胞
　　(1)利用Hoechst33342外排實驗，分離肺癌細胞系LLC“主側(cè)群”細胞。
　　(2)利用RT-PCR，Western blot及IF(immunofluorescence)鑒定各細胞亞群中的ABCG2和CD133含量。<

4、br>　　(3)利用FISH(Fluorescence in situ hybridization)檢測各細胞亞群ALK基因變異情況。
　　2、Crizotinib對肺癌細胞系LLC“主側(cè)群”細胞表型的影響及其分子機理研究
　　(1)運用藥敏試驗測定Crizotinib對肺癌細胞系LLC“主側(cè)群”細胞的最適作用濃度(IC50)和時間。
　　(2) Crizotinib處理后，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測細胞

5、凋亡，PI染色檢測細胞周期，并利用分光光度法檢測細胞內(nèi)Caspase-3、8、9活性。
　　3、Crizotinib對肺癌細胞系LLC“主側(cè)群”在裸鼠體內(nèi)成瘤的影響
　　(1)觀察各亞群的成瘤能力差異。
　　(2)經(jīng)Crizotinib治療后，定期測量腫瘤體積及重量。同時利用單抗CD31檢測血管密度。
　　4、Crizotinib對肺癌細胞系LLC“主側(cè)群”作用機制檢測。
　　(1)應(yīng)用SYBYL-Ⅹ1.3

6、等軟件模擬Crizotinib可能作用的蛋白活性中心，對可能的通路蛋白進行初篩。
　　(2)實驗證明Crizotinib誘導(dǎo)凋亡的可能機制。利用RNA芯片或Westernblot技術(shù)優(yōu)先檢測Smad3通路的變化。
　　結(jié)果：
　　1、利用Hoechst33342外排實驗分離LLC“主側(cè)群”細胞并鑒定
　　利用流式細胞技術(shù)確定“側(cè)群”細胞在總體細胞中的比例為0.37％。利用RT-PCR和Western blot分別

7、對LLC“主側(cè)群”細胞進行鑒定。結(jié)果表明“側(cè)群”細胞比“主群”細胞的CD133和ABCG2含量高。IF結(jié)果同樣顯示“側(cè)群”細胞比“主群”細胞CD133和ABCG2表達水平高。FISH結(jié)果顯示LLC“主側(cè)群”細胞均為ALK陰性細胞。
　　2、Crizotinib對肺癌細胞系LLC“主側(cè)群”細胞表型的影響
　　克隆形成實驗結(jié)果顯示，處理后“主群”細胞增殖受到抑制，并呈濃度依賴性。Crizotinib對“主群”細胞的IC50值為2

8、1.3 nM。Crizotinib和Verapamil(500μM)聯(lián)合用藥抑制“側(cè)群”細胞增殖，IC50值為22.4 nM。分別利用“主側(cè)群”細胞IC50值濃度的Crizotinib對其細胞進行作用，確定Crizotinib“主側(cè)群”細胞的最佳作用時間為24 h。最適作用濃度和時間用于后續(xù)試驗。研究發(fā)現(xiàn)處理后“主群”細胞凋亡增強和G1期阻滯，并且伴隨Caspase-3、8、9活性增高?！皞?cè)群”細胞未見明顯影響。Crizotinib和V

9、erapamil聯(lián)合用藥，結(jié)果顯示“側(cè)群”細胞出現(xiàn)凋亡和G1期阻滯，同時Caspase-3、8、9活性增高。
　　3、觀察Crizotinib對肺癌細胞系LLC“主側(cè)群”裸鼠荷瘤模型的影響
　　Crizotinib可以有效抑制LLC“主群”細胞裸鼠皮下移植瘤的生長，Crizotinib和Verapamil聯(lián)合用藥可以有效抑制LLC“側(cè)群”細胞裸鼠皮下移植瘤的生長。免疫組化結(jié)果顯示經(jīng)治療的裸鼠瘤內(nèi)血管密度明顯低于對照組。

10、>　　4、Crizotinib對肺癌細胞系LLC“主側(cè)群”作用機制檢測
　　SYBYL-Ⅹ1.3軟件模擬結(jié)果提示Crizotinib能夠與Smad3蛋白的活性中心結(jié)合。Western blot結(jié)果顯示經(jīng)Crizotinib處理后Smad2和3總量沒有變化，而P-Smad2和3明顯增高，進而誘導(dǎo)Smad4含量增高。RNA芯片結(jié)果顯示Smad2和3RNA含量沒有明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1、LLC“主側(cè)群”細胞在致癌性和