TRPC6介導(dǎo)DU145細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、前言:前列腺癌占男性惡性腫瘤相關(guān)致死原因的第二位。近年來，在中國前列腺癌的發(fā)病率和病死率有逐年上升的趨勢。新生血管的形成在前列腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起到重要的作用，血管內(nèi)皮生長因子在這個過程中是一個關(guān)鍵的介導(dǎo)。在體內(nèi)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞釋放血管生成物質(zhì)，如成纖維生長因子(FGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，可傳遞預(yù)形成血管壁的信號，從而開始血管形成的過程。腫瘤條件培養(yǎng)上清液中可能含有大量的促細(xì)胞分裂因子，幾乎所有由腫瘤細(xì)胞分泌的生長因子都可以誘

2、導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，最終經(jīng)過分化形成新的血管壁。
　　 鈣離子是普遍的細(xì)胞內(nèi)信使，控制多種細(xì)胞活動過程，如基因的轉(zhuǎn)錄，肌肉的收縮和細(xì)胞的增殖。TRP通道可能與腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。這是因?yàn)門RP都是鈣通道，允許鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。而在細(xì)胞內(nèi)，鈣離子作為第二信使，控制著細(xì)胞內(nèi)一系列重大生物活動，尤其是細(xì)胞的增殖。最近有研究表明，TRPC6通道參與多種細(xì)胞的增殖過程，本實(shí)驗(yàn)觀察DU145細(xì)胞條件培養(yǎng)液作用于hUVEC后，細(xì)胞增殖和TRPC6基

3、因及蛋白的表達(dá)情況，從而探討TRPC6在hUVEC細(xì)胞增殖過程中的作用。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、DU145細(xì)胞的培養(yǎng)及腫瘤條件培養(yǎng)液的制備
　　 在37℃，5％CO2，正常氧濃度，飽和濕度條件下，10％的胎牛血清，PRMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)DU145細(xì)胞至對數(shù)生長期，棄去培養(yǎng)液，重新加入不含血清的PRMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集培養(yǎng)液上清，即腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)液(TCM)，-20℃冰箱凍存，備用。

4、
　　 2、hUVEC細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 37℃，5％CO2，正常氧濃度，飽和濕度條件下，10％的胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)hUVEC細(xì)胞。
　　 3、實(shí)驗(yàn)分組
　　 對照組：用無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)hUVEC;實(shí)驗(yàn)組：將制備好的腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)液與無血清DMEM培養(yǎng)液分別按照1：2、1：1、2：1比例混合后培養(yǎng)hUVEC，作用48h。加干預(yù)因素前經(jīng)血清饑餓法達(dá)同步化。
　　 4、hUVEC細(xì)胞

5、增殖率的檢測
　　 將hUVEC細(xì)胞以5×103/孔的密度種植于96孔板，每孔200μL，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的腫瘤條件培養(yǎng)液，每組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h后進(jìn)行MTT檢測。檢測時在培養(yǎng)板內(nèi)每孔內(nèi)加入MTT染色劑20μL，培育4h，吸取孔內(nèi)液體，加入二甲基亞砜150μL，振蕩10min，以570nm波長酶標(biāo)儀檢測吸光值，用只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零。
　　 5、RT-PCR法檢測hU

6、VEC細(xì)胞TRPC6的mRNA的表達(dá)
　　 加入Trizol提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)后電泳檢測。
　　 6、Western blot檢測hUVEC細(xì)胞TRPC6蛋白質(zhì)的表達(dá)
　　 提取hUVEC細(xì)胞蛋白質(zhì)，測定蛋白濃度；蛋白質(zhì)的聚丙烯酞胺凝膠電泳；免疫印跡法；蛋白印跡的分析。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、腫瘤條件培養(yǎng)液對hUVEC細(xì)胞增殖的影響
　　 經(jīng)過48h的作用，

7、不同濃度的腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)液對hUVEC增殖的影響，與空白對照組比較，各個濃度組的吸光度有顯著的增加。各實(shí)驗(yàn)組中，hUVEC的增殖呈濃度依賴性，腫瘤培養(yǎng)上清液的濃度的增加，細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)。
　　 二、RT-PCR檢測TRPC6mRNA的表達(dá)
　　 實(shí)驗(yàn)組條帶灰度值高于空白對照組，并且隨腫瘤條件培養(yǎng)液濃度增高，表達(dá)增高，各組間有顯著性差異。
　　 三、Western-blot檢測TRPC6蛋白質(zhì)的表達(dá)