MRP8和MRP14介導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變的功能研究.pdf

1、髓樣相關(guān)蛋白8（MRP8，又叫做S100A8或Calgranulin A）和髓樣相關(guān)蛋白14（MRP14，又叫做S100A9或Calgranulin B）是兩種鈣離子結(jié)合蛋白，屬于鈣結(jié)合S100蛋白家族。并且MRP8和MRP14通常以MRP8/14復(fù)合物的形式存在。MRP8/14復(fù)合物占中性粒細(xì)胞胞漿總蛋白的40％，中性粒細(xì)胞激活后MRP8、MRP14和MRP8/14被特異性釋放，在骨髓分化、炎癥過程中發(fā)揮作用，并表現(xiàn)出抗菌活性。

2、>　　 血管內(nèi)皮細(xì)胞是一層半選擇通透性屏障。研究表明血管內(nèi)皮通透性增高涉及炎癥、燒傷、休克、免疫、腫瘤轉(zhuǎn)移等一系列病理過程的發(fā)生和發(fā)展，是全身炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，甚至是晚期休克患者死亡的主要原因之一。對內(nèi)皮細(xì)胞而言，MRP8和MRP14顯著增加了白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，并且能夠在體外誘導(dǎo)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。而最近有研究發(fā)現(xiàn)，MRP8/14(200μg/ml)刺激皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMEC)6 h后能夠?qū)е屡c內(nèi)皮細(xì)

3、胞完整性相關(guān)的多種基因下調(diào)，比如α-catenin，cadherin等;而另有文獻(xiàn)報道，MRP8和MRP14作為Toll樣受體4(TLR4)的內(nèi)源性配體，顯著加劇了內(nèi)毒素導(dǎo)致的休克。我們推測MRP8、MRP14在短時間內(nèi)就會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。
　　 MRP8和MRP14通過何種方式作用于內(nèi)皮細(xì)胞尚有爭論?，F(xiàn)在，人們越來越多的認(rèn)為，細(xì)胞外MRP8和MRP14通過細(xì)胞膜表面的模式識別受體——比如TLR4和RAGE來發(fā)揮其功能。

4、而在內(nèi)皮細(xì)胞TLR4和RAGE都有表達(dá)，因此，本研究將從受體的角度，探討MRP8、MRP14、MRP8/14是否是通過TLR4和（或）RAGE導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性的變化。
　　 絲裂原活化蛋白激酶（MRPKs）是一組絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，并且MAPKs幾乎表達(dá)于所有的細(xì)胞類型。MAPKs是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的重要組成元件，并且對調(diào)節(jié)基因表達(dá)、有絲分裂、代謝、凋亡、增殖、分化等具有重要的作用。而有證據(jù)表明MRP8/14能夠激活

5、JNK、p38和ERK1/2信號通路。因此在本研究中我們還將探討MAPKs是否參與了MRP8、MRP14和MRP8/14介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。
　　 目的:
　　 本研究以臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為靶點，探討MRP8、MRP14和MRP8/14能否介導(dǎo)HUVECs通透性增高，并且從受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度討論MRP8、MRP14和MRP8/14是否通過作用于TLR4和(或)RAGE激活MAPKs通路引起通透性增

6、高，從而進(jìn)一步闡明MRP8、MRP14和MRP8/14介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高的機(jī)制。
　　 方法:
　　 本研究以HUVECs為研究對象，采用細(xì)胞培養(yǎng)、跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(TER)測定、免疫印記、免疫熒光等方法，觀察MRP8、MRP14和MRP8/14對單層HUVECs TER的影響以及MRP8、MRP14和MRP8/14刺激之后F-actin和ZO-1形態(tài)學(xué)的變化，從而確定MRPs能否破壞HUVECs的屏障功能，引起HUV

7、ECs通透性增高;另外檢測MRP8、MRP14和MRP8/14對p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平的影響，并且采用p38特異性抑制劑SB203580、ERK1/2特異性抑制劑PD98059和JNK特異性抑制劑SP600125干預(yù)，觀察干預(yù)因素對MRPs介導(dǎo)HUVECs通透性增高的影響，從而證明MRPs是否通過MAPKs通路介導(dǎo)HUVECs通透性增高;同時，采用TLR4特異性抑制劑TAK242和anti-RAGE抗體干預(yù)，觀察封閉TL

8、R4和RAGE之后，對MRPs介導(dǎo)HUVECs通透性增高以及MRPs介導(dǎo)MAPKs磷酸化水平增高的影響，從而闡明MRPs是否通過TLR4和（或）RAGE介導(dǎo)HUVECs通透性增高;除此之外，我們還應(yīng)用無Ca2+液體（PBS或應(yīng)用EGTA螯合Ca2+）處理細(xì)胞，觀察Ca2+在MRPs介導(dǎo)HUVECs通透性增高中的作用，從而證明MRPs是否以Ca2+依賴性的方式介導(dǎo)HUVECs通透性增高。
　　 結(jié)果:
　　 1.MRPs以

9、時間依賴和劑量依賴的方式介導(dǎo)HUVECs通透性增高
　　 (1)濃度梯度的MRP8（0、0.5、1.0、2.0和4.0μg/ml）、MRP14(0、0.5、1.0、2.0和4.0μg/ml)和MRP8/14（0、0.5、1.0、2.0和4.0μg/ml）分別刺激單層HUVECs120 min，MRP8不同濃度之間有顯著性差異(F=79.604，P=0.000)，不同時間之間也有顯著性差異(F=114.348，P=0.000)，濃

10、度和時間之間存在交互效應(yīng)（F=34.266，P=0.000）。在相同的時間點，MRP8以濃度依賴的方式引起HUVECs通透性增高，并且在0-30 min內(nèi)，各濃度的MRP8都能以時間依賴性的方式引起HUVECs通透性增高。而在30 min后，MRP8介導(dǎo)的HUVECs通透性增高進(jìn)入一個相對穩(wěn)定的平臺期。與MRP8相似，MRP14和MRP8/14都能以時間依賴和濃度依賴的方式介導(dǎo)HUVECs通透性增高。MRP14和MRP8/14不同濃度之

11、間均有顯著性差異（F值分別為47.864和52.972，P值均為0.000），不同時間之間也均有顯著性差異（F值分別為112.496和158.498，P值均為0.000），濃度和時間之間存在交互效應(yīng)(F值分別為12.890和12.554，P值均為0.000)。但是與MRP8的作用方式不同，在加入刺激后0-120min內(nèi)，MRP14和MRP8/14介導(dǎo)的HUVECs通透性增高在時間上是逐漸增高的，并沒有平臺期的出現(xiàn)。
　　 (2)

12、在形態(tài)學(xué)上，MRP8（2.0μg/ml）刺激10min后，可見F-actin和ZO-1形成的致密帶被破壞，細(xì)胞內(nèi)F-actin形成明顯的應(yīng)力纖維，ZO-1分布不連續(xù)，呈現(xiàn)鋸齒狀裂隙。與MRP8刺激相似，MRP14和MRP8/14刺激之后，都可見F-actin應(yīng)力纖維的形成和ZO-1的破壞。這些結(jié)果為MRP8、MRP14和MRP8/14介導(dǎo)HUVECs通透性增高提供了形態(tài)學(xué)上的證據(jù)。
　　 2.MRPs通過p38和ERK1/2信號

13、轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)HUVECs通透性增高
　　 (1) MRP8（2.0μg/ml）分別刺激HUVECs0、10、30、60和120 min之后，各組之間p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平均有顯著性差異（F值分別為4.930、8.252和6.357;P值分別0.019、0.003和0.008）。MRP8（2.0μg/ml）刺激HUVECs10 min后，與正常對照組相比p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平都顯著性增高，并且當(dāng)MR

14、P8作用時間延長至30、60和120 min，p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平的增高均在30-60 min時達(dá)到峰值，而120 min時有所下降。同樣，MRP14和MRP8/14也能導(dǎo)致MAPKs磷酸化水平增高。MRP14刺激HUVECs之后，各組之間p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平均有顯著性差異（F值分別為7.882、12.974和7.506;P值分別0.004、0.001和0.005）;MRP8/14刺激HUVECs之后

15、，各組之間p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平也均有顯著性差異（F值分別為9.186、5.957和4.290;P值分別0.002、0.010和0.028）。并且MRP14和MRP8/14作用10 min后，p38和ERK1/2磷酸化水平與正常對照組相比顯著性增高，而JNK磷酸化水平雖然有所增高但與正常對照組相比卻無顯著性差異。而MRP14和MRP8/14作用30min，p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平與正常對照組相比都顯著性增高

16、。
　　 (2)分別采用p38、ERK1/2和JNK的特異性抑制劑SB203580、PD98059和SP600125預(yù)處理HUVECs60 min后，再給予MRP8、MRP14和MRP8/14刺激120 min，然后測量TER。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不管是MRP8、MRP14還是MRP8/14作為刺激物，不同分組之間均有顯著性差異(F值分別為83.647、85.645和137.528;P值均為0.000)，不同時間之間也均存在顯著性差異（F

17、值分別為399.476、260.949和987.621;P值均為0.000），分組因素和時間因素之間存在交互效應(yīng)（F值分別為31.689、18.633和80.156;P值均為0.000）。并且SB203580和PD98059能顯著抑制MRP8、MRP14和MRP8/14引起的HUVECs通透性增加。而SP600125對MRP8、MRP14和MRP8/14介導(dǎo)的通透性增高無影響。這提示:MRP8、MRP14和MRP8/14通過p38和ER

18、K1/2信號通路介導(dǎo)HUVECs通透性增高。
　　 (3)在形態(tài)學(xué)上，p38抑制劑SB203580和ERK1/2抑制劑PD98059能顯著抑制應(yīng)力纖維的形成和ZO-1的破壞。而JNK抑制劑SP600125對MRP8、MRP14和MRP8/14介導(dǎo)的應(yīng)力纖維形成、ZO-1破壞沒有抑制作用。以上結(jié)果在形態(tài)學(xué)上進(jìn)一步證明了MRP8、MRP14和MRP8/14通過p38和ERK1/2信號通路破壞HUVECs屏障功能。
　　 3.

19、MRP8通過TLR4、MRP14通過RAGE介導(dǎo)HUVECs通透性增高
　　 (1)分別用TLR4特異性抑制劑TAK242抑制TLR4、anti-RAGE抗體封閉RAGE，然后給予MRP8（2.0μg/ml）、MRP14（2.0μg/ml）和MRP8/14（2.0μg/ml）刺激HUVECs120 min，分別于0、60和120min測量TER。結(jié)果顯示:不管是MRP8、MRP14還是MRP8/14作為刺激物，不同分組之間均存在

20、顯著性差異(F值分別為126.431、74.816和30.440;P值均為0.000)，不同時間之間也有顯著性差異（F值分別為355.094、356.445和186.168;P值均為0.000），分組因素和時間因素之間存在交互效應(yīng)(F值分別為51.834、45.956和17.810;P值均為0.000)。并且TAK242顯著抑制了MRP8介導(dǎo)的HUVECs通透性增高，而anti-RAGE對MRP8介導(dǎo)的HUVECs通透性增高無影響;對于

21、MRP14而言，anti-RAGE而非TAK242顯著抑制了其介導(dǎo)的HUVECs通透性增高;而TAK242和anti-RAGE都可以抑制MRP8/14介導(dǎo)的通透性增高，并且當(dāng)兩種抑制劑合用時，其抑制效果更加顯著。
　　 (2)利用Western Blot檢測TAK242和anti-RAGE對MRP8、MRP14和MRP8/14介導(dǎo)p38和ERK1/2磷酸化水平增高的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)MRP8刺激HUVECs時，各組之間p38和E

22、RK1/2磷酸化水平均存在顯著性差異（F值分別為49.885和86.672，P值均為0.000），TAK242而非anti-RAGE顯著抑制了MRP8介導(dǎo)的p38和ERK1/2磷酸化水平增高;當(dāng)MRP14刺激HUVECs時，各組之間p38和ERK1/2磷酸化水平均存在顯著性差異（F值分別為11.023和8.402，P值均為0.000），并且與MRP8刺激不同，anti-RAGE而非TAK242顯著抑制了MRP14介導(dǎo)的p38和ERK1/

23、2磷酸化水平增高;當(dāng)MRP8/14刺激HUVECs時，各組之間p38和ERK1/2磷酸化水平均存在顯著性差異（F值分別為60.005和46.784，P值均為0.000），而TAK242和anti-RAGE都能抑制MRP8/14介導(dǎo)的p38和ERK1/2磷酸化水平增高，并且當(dāng)兩種抑制劑合用時，其抑制效果更加顯著。
　　 以上結(jié)果提示:MRP8通過TLR4、MRP14通過RAGE激活p38和ERK1/2信號通路從而介導(dǎo)HUVECs通

24、透性增高;而MRP8/14既可以通過TLR4又可以通過RAGE介導(dǎo)HUVECs通透性增高。
　　 4.MRPs介導(dǎo)HUVECs通透性增高是Ca2+依賴性的
　　 (1)在有或者無MRP8(2.0μg/ml)的情況下，HUVECs在無Ca2+環(huán)境(PBS)中孵育30 min，然后加入1.3 mM的Ca2+，繼續(xù)作用60 min，測量TER。結(jié)果顯示，各組之間存在顯著性差異（F=136.026，P=0.000），不同時間之間

25、也有顯著性差異(F=187.980，P=0.000)，而分組因素和時間因素之間存在交互效應(yīng)（F=101.373，P=0.000）。在無Ca2+條件下不管是否有MRP8刺激，與正常對照組相比，HUVECs通透性都升高，但PBS組與“PBS+MRP8”組相比無顯著性差異;當(dāng)加入1.3 mM的Ca2+后，PBS組通透性逐漸恢復(fù)，“PBS+MRP8”組HUVECs的通透性非但沒有恢復(fù)，反而繼續(xù)升高，與PBS組相比有顯著性差異。這些結(jié)果表明:在沒

26、有Ca2+時，MRP8不能導(dǎo)致HUVECs通透性增加，而在正常Ca2+濃度下，MRP8才能導(dǎo)致HUVECs通透性增高，即MRP8介導(dǎo)的HUVECs通透性增加是Ca2+依賴性的。為了進(jìn)一步證明MRP8介導(dǎo)HUVECs通透性增加是Ca2+依賴性的，我們先用無Ca2+液體(PBS)處理HUVECs30min，然后用經(jīng)過濃度梯度Ca2+（0、0.25a、0.5a和a，a=0.37μM，為剛好飽和2.0μg/ml MRP8鈣離子結(jié)合位點的Ca2+

27、濃度）孵育的MRP8(2.0μg/ml)刺激60 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同組之間存在顯著性差異（F=405.592，P=0.000），不同時間之間也有顯著性差異（F=1647.036，P=0.000），而分組因素和時間因素之間存在交互效應(yīng)(F=128.156，P=0.000)。在相同濃度MRP8、不同濃度Ca2+刺激下，HUVECs通透性呈Ca2+濃度依賴性的增加。這進(jìn)一步說明，MRP8介導(dǎo)的HUVECs通透性增加是Ca2+依賴性的。采用

28、相同的方法，我們發(fā)現(xiàn)MRP14介導(dǎo)的HUVECs通透性增加也是Ca2+依賴性的。
　　 (2)另外，我們分別在正常Ca2+濃度和無Ca2+環(huán)境中利用MRP8(2.0μg/ml)和MRP14(2.0μg/ml)刺激HUVECs120 min，western blotting檢測p38和ERK1/2磷酸化水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn):各組之間p38和ERK1/2磷酸化水平均存在顯著性差異（F值分別為47.041和234.488，P值均為0.

29、000），并且在無Ca2+條件下MRP8和MRP14都不能引起p38和ERK1/2磷酸化水平的增高;而在正常Ca2+下，MRP8和MRP14能夠引起p38和ERK1/2磷酸化水平顯著性增高。
　　 以上結(jié)果提示:MRP8和MRP14都以Ca2+依賴性的方式激活p38和ERK1/2信號通路，從而導(dǎo)致HUVECs通透性增高。
　　 結(jié)論:
　　 1.MRP8、MRP14和MRP8/14都能夠以時間依賴和劑量依賴的方式