IP-10 SiRNA對血管平滑肌細胞增殖的影響及其對血管再狹窄的防治作用.pdf

1、研究背景:
　　 血管再狹窄是限制血管成形術遠期療效的主要原因，是一系列復雜的病理生理過程聯(lián)合作用的結果，以血管平滑肌細胞擴增、遷移為主要病理特征。研究表明，IP-10可能具有潛在的促進血管平滑肌細胞擴增和遷移的作用，在動脈粥樣硬化形成的過程中，血管壁細胞IP-10的高表達在活化T細胞的募集和定植中發(fā)揮了作用，粥樣斑塊的內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞均有IP-10的高表達。在同種異體移植物的血管病變中，IP-10的高表達促進了以

2、免疫介導的平滑肌細胞擴增為特征的血管病變的發(fā)生。針對血管再狹窄的病理基礎，本研究試圖將IP-10作為新的靶點，運用具有高效、高特異性的RNA干擾技術，沉默其在血管平滑肌細胞中的表達，研究其在血管平滑肌細胞擴增過程中發(fā)揮的作用，并進一步研究其在體內血管再狹窄復雜過程中發(fā)揮的作用。
　　 目的:
　　 研究RNA干擾技術沉默IFN-γ誘導蛋白10(IP-10)基因后對血管平滑肌細胞增殖的影響，探討IP-10在血管損傷后內膜過

3、度增生過程中發(fā)揮的作用。
　　 方法:
　　 1、根據(jù)GeneBank報道的IP-10核酸序列和SiRNA設計原則，設計并合成針對IP-10的2條小干擾RNA，構建針對IP-10的SiRNA表達質粒pSilence 2.0-U6，并進行酶切鑒定和測序；
　　 2、原代培養(yǎng)血管平滑肌細胞，將構建好的IP-10SiRNA真核表達質粒轉染入原代培養(yǎng)平滑肌細胞中，RT-PCR及Western blot檢測細胞IP-10表

4、達，MTT法檢測細胞增殖速率；
　　 3、球囊擴張加高膽固醇飲食構建新西蘭兔左頸總動脈內膜損傷模型，將IP-10 SiRNA局部轉染入損傷血管，分別于轉染后1周和4周末取標本，RT-PCR和免疫組化檢測IP-10表達；HE染色觀察血管形態(tài)，比較血管內膜中膜比；電子顯微鏡觀察血管內膜增生狀態(tài)。
　　 結果:
　　 1、酶切結果顯示重組質粒插入片段大小與預期相符，測序結果證實該重組質粒序列與所設計序列完全一致，表明針

5、對IP-10的SiRNA真核表達質粒構建成功。
　　 2、IP-10 SiRNA轉染后48小時，細胞IP-10表達與未轉染組比較明顯降低，細胞生長速度減慢(P＜0.05)。
　　 3、兔頸總動脈轉染IP-10SiRNA一周和四周后，IP-10局部表達較未轉染組明顯降低。4周時，轉染組血管內膜中膜比較未轉染組減少(P＜0.01)，同時，電子顯微鏡下，干擾組內膜結構較未轉染組規(guī)則、平整，增生較輕。
　　 結論:

6、>　　 1、設計、合成了一個針對IP-10的特異性RNA干擾核苷酸序列，成功構建了針對IP-10基因的SiRNA真核表達載體。
　　 2、SiRNA表達載體轉染可有效抑制內源性基因表達，本研究中質粒pSilencer2.0-U6-siIP-10轉染可有效抑制IP-10mRNA和蛋白水平表達，并抑制血管平滑肌細胞增殖。
　　 3、體內實驗中證實局部轉染pSilencer2.0-U6-siIP-10成功抑制了IP-10的表