大鼠體外多器官細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立及在納米物質(zhì)毒性研究中的應(yīng)用.pdf

1、本文探討建立大鼠體外多器官細(xì)胞共培養(yǎng)方法作為毒性靶器官篩選或研究模型的可能性；將所建模型初步應(yīng)用于在納米物質(zhì)的毒性研究。 方法：1．采用膠原酶消化法、支氣管灌洗分離法、兩步消化法等方法分離大鼠原代肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞，用單層貼壁法分別培養(yǎng)；采用飛片法，將五種細(xì)胞的飛片放入同一培養(yǎng)皿，用10％FBS DMEM作為培養(yǎng)基建立多器官細(xì)胞共培養(yǎng)方法。2．大鼠體外多器官細(xì)胞共培養(yǎng)作為靶器官毒性研究模型的初

2、步研究：以已知毒性的四氯化碳、氟化鈉、二氧化硅、氯化鎘、醋酸鉛為毒物，驗證其靶器官效應(yīng)。用MTT法檢測細(xì)胞毒性；用生物化學(xué)方法檢測培養(yǎng)液中特異生化指標(biāo)的變化如：檢測培養(yǎng)液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、大鼠促紅細(xì)胞生成素(EPO)、大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTn-Ⅰ)、大鼠巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(MIP-2)、乳酸脫氫酶(LDH)的含量。3．在此基礎(chǔ)上，初步應(yīng)用于納米TiO2和單壁碳納米管的研究。 結(jié)果：1．建立的大鼠原代肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、心肌細(xì)

3、胞、肺泡巨噬細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞分離方法穩(wěn)定，臺盼蘭染色法檢測細(xì)胞分離成活率達(dá)90％左右，細(xì)胞生長狀態(tài)良好。2．大鼠五種原代細(xì)胞組成的多器官細(xì)胞共培養(yǎng)方法結(jié)果顯示，五種原代細(xì)胞在共培養(yǎng)時細(xì)胞生長增殖情況良好，單獨培養(yǎng)與共培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線基本重合。3．本試驗結(jié)果顯示，四氯化碳根據(jù)IC50值對這五種細(xì)胞的毒性從大到小依次為：肝細(xì)胞＞肺泡巨噬細(xì)胞＞心肌細(xì)胞＞腎細(xì)胞＞真皮成纖維細(xì)胞；CCL4對肝細(xì)胞的劑量-反應(yīng)曲線變化趨勢明顯不同于其它細(xì)胞；從

4、引起生化指標(biāo)改變起始濃度中最敏感的是指標(biāo)是ALT和cTn-Ⅰ。氟化鈉根據(jù)IC50值對五種細(xì)胞的毒性從大到小依次為：腎細(xì)胞＞肺泡巨噬細(xì)胞＞心肌細(xì)胞＞肝細(xì)胞＞真皮成纖維細(xì)胞；NaF對腎細(xì)胞的劑量-反應(yīng)曲線變化趨勢明顯不同于其它細(xì)胞；從引起生化指標(biāo)改變起始濃度中最敏感的指標(biāo)是Epo和cTn-Ⅰ。氯化鎘根據(jù)IC50值對五種細(xì)胞的毒性從大到小依次為：腎細(xì)胞＞心肌細(xì)胞＞肺泡巨噬細(xì)胞＞肝細(xì)胞＞真皮成纖維細(xì)胞；從引起生化指標(biāo)改變起始濃度中最敏感的指標(biāo)是

5、Epo，均表明腎細(xì)胞是氯化鎘最敏感的毒作用靶細(xì)胞。但從劑量-反應(yīng)曲線變化趨勢各種細(xì)胞比較近似，而且對五種細(xì)胞的毒性均較大，IC50也相近，提示氯化鎘對多種靶細(xì)胞都有毒性。二氧化硅根據(jù)IC50值對五種細(xì)胞的毒性從大到小依次為：肺泡巨噬細(xì)胞＞心肌細(xì)胞＞肝細(xì)胞＞真皮成纖維細(xì)胞＞腎細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞的劑量-反應(yīng)曲線變化趨勢明顯不同于其它細(xì)胞，從引起生化指標(biāo)改變起始濃度中最敏感的指標(biāo)是MIP-2。醋酸鉛根據(jù)IC50值對五種細(xì)胞的毒性從大到小依次為

6、：肺泡巨噬細(xì)胞＞心肌細(xì)胞＞真皮成纖維細(xì)胞＞腎細(xì)胞＞肝細(xì)胞。醋酸鉛對各種細(xì)胞毒性的劑量-反應(yīng)曲線變化趨勢和IC50相近，肺泡巨噬細(xì)胞相對較敏感，與上述其它毒物的毒作用特征相比似無特別敏感的靶細(xì)胞。從引起生化指標(biāo)改變起始濃度中最敏感的指標(biāo)是cTn-Ⅰ。4．納米二氧化鈦的毒性大于常規(guī)尺度的TiO2；隨著納米二氧化鈦的尺寸變小，其對各器官細(xì)胞毒性增大；常規(guī)尺度TiO2的主要靶器官可能是肺和心臟，納米TiO2提示隨著納米尺度的變小，損傷的靶器官可

7、能增多；單壁碳納米管毒性大于常態(tài)碳黑顆粒；兩者的靶器官有可能不同，碳黑顆粒的靶器官可能是肺和心臟，單壁碳納米管可能有多個靶器官。 結(jié)論： 1．首次建立了大鼠多器官細(xì)胞共培養(yǎng)方法。 2．大鼠多器官細(xì)胞共培養(yǎng)方法可作為毒性靶器官的研究模型，通過多器官細(xì)胞共培養(yǎng)模型將檢測細(xì)胞毒性和其特異性指標(biāo)的結(jié)合，可有效的識別出化學(xué)物的靶器官毒性。但上述研究結(jié)果是初步的，對于多器官細(xì)胞共培養(yǎng)的器官、毒性評價指標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn)等均有待于優(yōu)化、