大鼠骨髓基質(zhì)干細胞與肌腱細胞在體外間接共培養(yǎng)的實驗研究.pdf

1、目的：肌腱病的治療是臨床骨科的難點，骨髓基質(zhì)干細胞的應用為肌腱病的治療提供了新思路。骨髓基質(zhì)干細胞具有多向分化潛能并可以被誘導分化為多種細胞，但由于骨髓基質(zhì)干細胞的分化機制及在治療過程中的作用方式尚未明確，限制了其在肌腱病治療中的應用。本課題通過體外構(gòu)建骨髓基質(zhì)干細胞與自體肌腱細胞的間接共培養(yǎng)體系，在單純間接共培養(yǎng)環(huán)境下與間接共培養(yǎng)同時添加自體富血小板血漿進行干預的情況下研究間接共培養(yǎng)環(huán)境對骨髓基質(zhì)干細胞的分化誘導作用，以探索骨髓基質(zhì)干

2、細胞的分化機制并為骨髓基質(zhì)干細胞在肌腱病治療中的應用提供參考。
　　 方法：應用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠肌腱細胞。體外采集大鼠骨髓基質(zhì)干細胞并擴增。采集大鼠血液制備富血小板血漿并激活以獲取富血小板血漿萃取液。利用孔徑0.4μm的細胞共培養(yǎng)嵌盒與6孔板構(gòu)建培養(yǎng)液相通但細胞不直接接觸的間接共培養(yǎng)體系。將生長狀態(tài)良好的第三代(P3)大鼠肌腱細胞及第四代大鼠骨髓基質(zhì)干細胞(P4)用于實驗，實驗組骨髓基質(zhì)干細胞被接種于間接共培養(yǎng)體系外室，

3、將同體肌腱細胞種植于內(nèi)室，另外單獨設置一組間接共培養(yǎng)組并加入富血小板血漿萃取液。于間接共培養(yǎng)后第3天、第7天及第10天，分別提取各組間接共培養(yǎng)體系內(nèi)外室的細胞進行形態(tài)學觀察，并利用RT-PCR及免疫組化染色技術(shù)分別對各組肌腱細胞與骨髓基質(zhì)干細胞的Ⅰ型膠原與腱調(diào)蛋白(TNMD)進行基因?qū)用媾c蛋白層面的檢測，以分析間接共培養(yǎng)環(huán)境對骨髓基質(zhì)干細胞分化與細胞外基質(zhì)表達的影響。
　　 結(jié)果：應用組織塊培養(yǎng)法成功分離出細胞，并經(jīng)鑒定證實為肌

4、腱細胞。應用肌腱細胞與骨髓基質(zhì)干細胞間接共培養(yǎng)3天后，間接共培養(yǎng)組的骨髓基質(zhì)干細胞在RT-PCR檢測與免疫組化染色檢測中均未表達Ⅰ型膠原與腱調(diào)蛋白(TNMD)。間接共培養(yǎng)7天后，間接共培養(yǎng)組干細胞在Ⅰ型膠原的PCR電泳圖像中出現(xiàn)模糊條帶，同時Ⅰ型膠原免疫組化顯示部分細胞呈弱陽性染色，單純間接共培養(yǎng)組與富血小板血漿干預組之間結(jié)果無顯著差異。間接共培養(yǎng)組干細胞在各種檢測中未出現(xiàn)對腱調(diào)蛋白(TNMD)的表達。間接共培養(yǎng)10天后，間接共培養(yǎng)組干

5、細胞在Ⅰ型膠原的PCR電泳圖像中出現(xiàn)清晰條帶，但亮度低于肌腱細胞對照組。同時Ⅰ型膠原免疫組化顯示間接共培養(yǎng)組干細胞呈廣泛弱陽性染色，通過測定免疫組化結(jié)果的平均光密度進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示間接共培養(yǎng)組骨髓基質(zhì)干細胞Ⅰ型膠原表達量顯著高于干細胞陰性對照組，但低于肌腱細胞對照組。間接共培養(yǎng)組干細胞在腱調(diào)蛋白(TNMD)的PCR電泳圖像中表現(xiàn)為模糊條帶，但腱調(diào)蛋白(TNMD)免疫組化染色結(jié)果為陰性。
　　 結(jié)論：通過組織塊培養(yǎng)法可以在