鼻咽癌14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因甲基化與其表達關系的研究.pdf

1、鼻咽癌(NPC)是我國南方地區(qū)常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病機制還不清楚。DNA甲基化修飾是基因表達調控的重要表觀遺傳學機制之一，DNA甲基化修飾導致抑瘤基因等的沉默在癌變過程中發(fā)揮重要的作用。因此，篩選NPC的甲基化失活基因將有助于揭示NPC的發(fā)病機制，具有重要的理論和應用價值。本研究室前期采用蛋白質組學技術比較激光捕獲顯微切割純化的NPC組織與正常鼻咽黏膜組織蛋白質表達譜的差異，發(fā)現(xiàn)NPC組織中14-3-3σ、Annexin A1和SC

2、CA1蛋白質表達降低，但其表達下調的機制不清楚。 為探討NPC 14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因表達下調是否由啟動子甲基化引起，本研究以4株具有不同分化程度和轉移潛能的NPC細胞系(CNE1、CNE2、5-8F、6-10B)、1株永生化的鼻咽上皮細胞系NP69，以及75例NPC組織和25例正常鼻咽黏膜組織作為實驗對象，采用甲基化特異性PCR(MSP)、RT-PCR、Western blotting和免疫組織化

3、學分別檢測14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因啟動子甲基化情況、mRNA和蛋白質的表達水平；利用不同濃度(0、0.1、1、5、10 μmol/L)的去甲基化藥物5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2dC)處理NPC細胞株，采用MTT比色檢測細胞生長，流式細胞儀檢測細胞周期分布和細胞凋亡。 主要結果如下：(1)與正常鼻咽黏膜組織比較，NPC組織14-3-3σ(84％VS 28％)、Annexin A1(92％VS

4、 12％)和SCCA1(87％VS 22％)基因啟動子出現(xiàn)高頻甲基化；(2)在14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因啟動子完全甲基化NPC組織中，其mRNA和蛋白質的表達缺失；在14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因啟動子不完全甲基化NPC組織中，其mRNA和蛋白質的表達顯著低于未甲基化的NPC組織；14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因甲基化與其表達水平高度負相關；(3)14-3-3σ、Ann

5、exin A1、SCCA1基因啟動子甲基化與NPC淋巴結轉移正相關；(4)NP69細胞系14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因啟動子未甲基化，4株NPC細胞系14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因啟動子均存在不同程度的甲基化，而且其甲基化程度與細胞系的分化程度和轉移潛能有關，分化程度越低甲基化程度越高，轉移潛能越大甲基化程度越高；(5)NPC細胞系14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1mRNA表達水

6、平低于NP69細胞；(6)5-aza-2dC呈濃度依賴性地抑制4株NPC細胞系14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因甲基化，上調其mRNA和蛋白質的表達；(7)5-aza-2dC呈濃度依賴性地抑制4株NPC細胞系的生長，促進細胞凋亡，導致細胞周期阻滯，而且高分化CNE1和無轉移6-10B細胞對藥物的敏感性高于低分化CNE2和高轉移5-8F細胞。 本研究首次報道14-3-3σ、AnnexinA1和SCCA1基因在NP

7、C中出現(xiàn)高頻甲基化，啟動子甲基化是導致NPC 14-3-3σ、AnnexinA1和SCCA1基因表達缺失或降低的原因之一，14-3-3σ、AnnexinA1和SCCA1基因是新的NPC甲基化沉默基因；本研究發(fā)現(xiàn)14-3-3σ、AnnexinA1和SCCA1啟動子甲基化與NPC淋巴結轉移正相關，提示14-3-3σ、AnnexinA1和SCCA1啟動子甲基化可能成為預測NPC轉移的指標；本研究結果顯示去甲基化藥物5-aza-2dC能抑制NP