14-3-3σ基因甲基化失活與鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系及鼻咽癌血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國南方及東南亞一種與遺傳和環(huán)境因素密切相關(guān)的常見腫瘤。至今NPC發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍然不清楚。NPC早期臨床癥狀不明顯，易早期發(fā)生頸部淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，絕大多數(shù)NPC病人就診時(shí)已是中晚期，導(dǎo)致療效不佳。因此，本研究一方面從NPC的甲基化失活基因著手，研究14-3-3σ基因甲基化與NPC侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以期能為揭示NPC的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供理論和科學(xué)依據(jù)；另一方面，采用血清蛋白質(zhì)組

2、學(xué)方法尋找NPC的血清標(biāo)志物，以期能為NPC的診治提供幫助。 一、14-3-3σ基因甲基化與NPC侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究 14-3-3 sigma（σ）蛋白是一種潛在的腫瘤抑瘤蛋白，是細(xì)胞周期G2/M期檢控點(diǎn)的負(fù)性調(diào)節(jié)子。我們前期的蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)14-3-3σ蛋白在NPC中表達(dá)下調(diào)，但14-3-3σ在NPC中表達(dá)水平下調(diào)的機(jī)制及意義尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。為揭示14-3-3σ在NPC中表達(dá)下調(diào)的機(jī)制及其作用，本研究以7

3、5例NPC組織、25例正常鼻咽黏膜組織、4株分化程度或轉(zhuǎn)移潛能不同的NPC細(xì)胞系（CNE1、CNE2、5-8F、6-10B）和永生化的鼻咽上皮細(xì)胞系NP69為樣本，（1）采用甲基化特異性PCR（MSP）、RT-PCR、Western blotting和免疫組化等方法檢測(cè)14-3-3σ基因的甲基化狀態(tài)和表達(dá)水平，分析14-3-3σ基因甲基化與其表達(dá)水平之間的關(guān)系及其臨床病理意義；（2）采用MTT和流式細(xì)胞技術(shù)觀察去甲基化藥物5-雜氮-2-

4、脫氧胞苷（5-aza-2dC）對(duì)NPC細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期分布的影響；（3）采用基因轉(zhuǎn)染和Transwell小室實(shí)驗(yàn)分析14-3-3σ表達(dá)水平對(duì)NPC細(xì)胞體外侵襲能力的影響。主要結(jié)果如下： （1）4株NPC細(xì)胞系的14-3-3σ基因啟動(dòng)子均存在甲基化，而永生化人鼻咽上皮細(xì)胞株NP69的14-3-3σ基因啟動(dòng)子缺乏甲基化。5-aza-2dC處理后，4株NPC細(xì)胞系的14-3-3σ基因甲基化水平下降而其表達(dá)水平上調(diào)；（2）5-a

5、za-2dC呈濃度依賴性地抑制4株NPC細(xì)胞系的生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，而且高分化CNE1和無轉(zhuǎn)移6-10B細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性高于低分化CNE2和高轉(zhuǎn)移5-8F細(xì)胞；（3）14-3-3σ啟動(dòng)子甲基化的頻率在NPC組織顯著高于正常鼻咽上皮組織（84％VS28％），而且14-3-3σ基因完全甲基化只存在于NPC組織；（4）14-3-3σ基因在NPC組織中表達(dá)下調(diào)或丟失，且與14-3-3σ基因甲基化狀態(tài)相關(guān)；（5）14-3-3σ

6、甲基化的NPC患者有更高頻率的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及更晚的臨床分期；（6）上調(diào)14-3-3σ表達(dá)能夠抑制高轉(zhuǎn)移潛能NPC細(xì)胞株5-8F的體外侵襲能力。 二、鼻咽癌血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究 以19例NPC組織及患者自身血清和19例健康人血清為樣本，采用血清蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選NPC抗原及自身抗體。首先，應(yīng)用雙向凝膠電泳（2-DE）分離NPC組織蛋白質(zhì)，將膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再分別與NPC患者自身血清及健康人對(duì)照血清

7、進(jìn)行Western blotting反應(yīng)，獲取Western blotting反應(yīng)圖譜，圖像分析識(shí)別差異反應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，再用質(zhì)譜技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)方法對(duì)差異反應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定，共鑒定了13個(gè)可以在多數(shù)NPC患者體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生自身抗體的抗原蛋白，其中CK19、EBP1和Rho-GDI-2抗體分別在47.4％、47.4％和36.8％的NPC患者血清中能檢測(cè)到。 為驗(yàn)證血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果的可靠性，采用免疫共沉淀將CK19、EB

8、P1和Rho-GDI-2蛋白從NPC細(xì)胞株CNE2的總蛋白中純化出來，SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以它們作為抗原，采用Western blotting分析在新收集的30例NPC患者血清、23例其它腫瘤患者血清及20例健康人血清中的存在情況。結(jié)果顯示：CK19、EBP1和Rho-GDI-2抗體在NPC患者血清中的陽性率明顯高于其它腫瘤患者及健康人。結(jié)果表明：采用血清蛋白質(zhì)組學(xué)篩選到的NPC抗原及其自身抗體結(jié)果可靠，CK19、

9、EBP1和Rho-GDI-2抗體具有NPC特異性。 為探討NPC組織CK19、EBP1和Rho-GDI-2蛋白產(chǎn)生免疫原性的機(jī)制，以30例NPC組織及30例正常鼻咽粘膜上皮組織為樣本，采用Western blotting和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CK19、EBP1和Rho-GDI-2蛋白的表達(dá)和亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果顯示，CK19和EBP1在NPC組織中的表達(dá)比正常鼻咽粘膜上皮組織明顯升高，而Rho-GDI-2在正常組織和NPC組織中

10、的表達(dá)則沒有明顯差別，CK19、EBP1和Rho-GDI-2在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位一致。結(jié)果提示，CK19和EBP1過表達(dá)可能是其產(chǎn)生免疫原性、誘導(dǎo)NPC患者體內(nèi)產(chǎn)生自身抗體的原因之一，而NPC組織Rho-GDI-2的免疫原性可能與翻譯后修飾有關(guān)。 為探討分析CK19、Rho-GDI-2、HSP70和LAP3自身抗體診斷NPC的價(jià)值，采用ELISA方法檢測(cè)CK19、Rho-GDI-2、HSP70和LAP3四個(gè)自身抗體

11、在新收集的36例NPC患者、20例其它腫瘤患者和20例健康人血清中的水平，分析單個(gè)自身抗體以及自身抗體聯(lián)合對(duì)NPC判別的特異性和敏感性。結(jié)果顯示：4個(gè)自身抗體的血清水平在NPC患者和其他腫瘤患者均明顯高于健康人，以單個(gè)自身抗體作為判別NPC的指標(biāo)，Rho-GDI-2抗體具有更高的敏感性，而HSP70抗體的特異性最高；利用4個(gè)自身抗體組成的聯(lián)合判別函數(shù)對(duì)NPC判別的敏感性為41.7％（15/36），特異性為95％（19/20）。