Ad5-F35嵌合型增殖腺病毒SG235-TRAIL治療胃癌的實驗研究.pdf

1、增殖型腺病毒又稱條件復制型腺病毒或溶瘤病毒,可利用腫瘤與正常組織細胞間結構及代謝途徑的差異,靶向性地在腫瘤細胞內(nèi)復制增殖,最終裂解腫瘤細胞,同時能長效表達抗腫瘤的外源基因。常用的5型增殖型腺病毒具有可復制、體積小、彌散能力強等優(yōu)點,但也存在感染效率不高及毒副作用強等問題。人35型腺病毒(Ad35)屬于B2亞群,與傳統(tǒng)的5型等C組腺病毒載體相比有許多優(yōu)點：血清中的中和抗體陽性率較低；與5型腺病毒(Ad5)無免疫交叉反應；感染細胞不依賴CA

2、R受體,能夠高效感染多種重要的干細胞及原代腫瘤細胞；肝臟毒性低,免疫副作用小等。用35血清型腺病毒的纖毛蛋白的knob和shaft替換傳統(tǒng)5型腺病毒載體纖毛蛋白的knob和shaft,構建具有嵌合型纖毛蛋白的Ad5/F35腺病毒。此類Ad5/F35腺病毒載體繼承了Ad35的感染特性,能有效轉(zhuǎn)導CAR表達不足的多種重要靶細胞,尤其是對腫瘤細胞及造血干細胞、間充質(zhì)干細胞等有較高的感染效率。研究表明,在感染腫瘤細胞及造血干細胞等細胞時,Ad5

3、/F35嵌合增殖型腺病毒載體是比5型增殖型腺病毒更高效的轉(zhuǎn)基因載體,在胃癌等惡性腫瘤的基因治療中具有良好前景。 TRAK,(TNF-related apoptosis inducing ligand)即腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體,又稱凋亡素2配體(Apo2 ligand,Apo2L),是TNF家族重要的促凋亡分子。腫瘤的發(fā)生發(fā)展取決于多種促凋亡基因與抑凋亡基因的體內(nèi)平衡,而TRAIL作為一種選擇性胞漿毒素蛋白,能夠選擇性誘導胃

4、癌等多種腫瘤細胞凋亡。有研究者利用5型增殖型腺病毒載體攜帶TRAIL基因,構建了腺病毒ZD55-TRAIL并用于治療肝癌,實驗結果表明該病毒能一定程度上殺傷腫瘤細胞,與化療藥物或攜帶其他腺病毒聯(lián)用效果更佳。 基于以上研究根據(jù),本研究構建了攜帶TRAIL基因的Ad5/F35嵌合型增殖腺病毒SG235-TRAIL,希望利用Ad5/F35嵌合型增殖腺病毒更強的腫瘤感染能力與殺傷作用,提高TRAIL的腫瘤殺傷能力。不僅如此,本研究還將S

5、G235-TRAIL與化療藥泰素聯(lián)用,通過體外實驗探索其對胃癌的殺傷能力及安全性。 1.Ad5/F35嵌合型增殖腺病毒SG235-TRAIL的構建在前期實驗中,已經(jīng)通過分子生物學技術將Ad5的fiber的knob和shaft替換為Ad35 fiber的knob和shaft,構建嵌合型Ad5/F35腺病毒骨架質(zhì)粒SG235。將攜帶TRAIL基因的穿梭質(zhì)粒pZD55-FRAIL與35型腺病毒骨架質(zhì)粒SG235通過Lipofectam

6、ine 2000共轉(zhuǎn)染至293細胞。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑,經(jīng)過三次病毒空斑純化,提取腺病毒DNA并應用PCR進行鑒定,經(jīng)鑒定正確的腺病毒命名為SG235-TRAIL;同時重組出Ad5/F35嵌合型非增殖腺病毒AD5/35-TRAlL與Ad5/F35嵌合型增殖腺病毒SG235-EGFP。將重組出的病毒在293細胞中反復大量擴增,通過氯化銫密度梯度離心法進行純化,并用TCID50法測得重組腺病毒SG235-TRAIL的滴度達到6.

7、3×109pfu/ml。 2.腺病毒SG235-TRAIL治療胃癌的體外實驗將攜帶綠色熒光蛋白(EGFP)的Ad5/F35嵌合型增殖腺病毒SG235-EGFP與5型增殖型腺病毒SG5-EGFP分別感染胃癌細胞SGC-7901與正常成纖維細胞BJ,結果表明SG235-EGFP對胃癌細胞的感染性強于SG5-EGFP,對正常細胞的感染性并未增強,且SG235-EGFP在胃癌細胞中能夠不斷增殖并增強目的基因的表達；增殖實驗表明SG235

8、-TRAIL能在胃癌細胞SGC-7901與BGC-823內(nèi)大量復制,在正常細胞內(nèi)復制擴增卻很弱；通過ELISA、Western Blot及免疫熒光實驗確定SG235-TRAIL能高效感染胃癌細胞SGC-7901與BGC-823并大量表達目的基因TRAIL;將5型增殖型腺病毒ZD55-TRAIL、增殖腺病毒SG235.EGFP、非增殖型腺病毒AD5/35-TRAIL、SG235-TRAIL及SG235-TRAIL聯(lián)合化療藥紫杉醇(泰素)共

9、同感染細胞,通過MTT與CPE實驗評價細胞存活率并進行病毒的胃癌殺傷作用比較,并通過流式細胞儀檢測細胞的凋亡程度以研究SG235-TRAIL誘導胃癌細胞凋亡的能力。一系列體外實驗結果表明SG235-TRAIL對胃癌有很強的感染能力與腫瘤殺傷作用,安全性良好；與泰素聯(lián)用后SG235-TRAIL的抗腫瘤效應明顯增強,對正常細胞的毒性并未明顯增加。 3.腺病毒SG235-TRAIL治療胃癌的體內(nèi)實驗將BALB/c裸鼠皮下注射SGC-7

10、901細胞懸液,建立胃癌動物模型。將動物隨機分為4組,分別瘤內(nèi)注射PBS、SG235-EGFP、AD5/35-TRAIL及SG235-TRAIL治療。自接種之日起,定期用測量腫瘤體積；6周后將腫瘤組織取出稱重,固定后制成石蠟病理切片。將腫瘤組織切片進行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察組織病變情況,同時做免疫組化檢測TRAIL的表達及TUNEL凋亡檢測。體內(nèi)實驗結果說明,攜帶TRAIL基因的Ad5/F35嵌合型增殖腺病毒SG235-TRAIL