雙靶向增殖型腺病毒SG502-p53治療鼻咽癌的體外實驗研究.pdf

1、鼻咽癌是我國常見的惡性腫瘤之一，尤其在廣東及其周邊地區(qū)。近年來治愈率雖有所提高，但國內(nèi)5年生存率仍在50％～55％之間。隨著病毒分子生物學迅速發(fā)展，腫瘤的病毒治療正逐步從實驗室進入臨床。但其進展緩慢，主要原因是傳統(tǒng)的病毒治療缺乏腫瘤細胞靶向性，無法進一步提高其腫瘤殺傷能力。直到上個世紀下葉，分子生物學取得突破性進展，人們對病毒的基因結(jié)構(gòu)和功能有了更深的認識，能夠通過基因工程技術(shù)對病毒進行人工改造，出現(xiàn)了腫瘤特異性增殖型病毒(Tumor-

2、specificreplication-competentviruses)，這種狀況才有所改變。這種病毒的特點是靶向性作用于腫瘤細胞，對正常細胞幾乎沒有影響。與傳統(tǒng)治療方法機制完全不同，病毒在腫瘤細胞內(nèi)大量增殖，溶解腫瘤細胞后，釋放出的子病毒能夠進一步殺傷周圍的腫瘤細胞，不斷重復此過程，理論上直到腫瘤細胞全部被殺滅。這種治療腫瘤的方法，一般不引起嚴重的毒副作用，無限毒劑量。代表此類病毒的是美國ONYX藥物公司研制的增殖型腺病毒ONYX-

3、015。雖然它的出現(xiàn)曾給腫瘤的治療帶了希望，然而其單獨使用時的療效很小，有效率僅為15％。須聯(lián)合毒副作用很大的放化療措施，才能較為有效地殺傷腫瘤，有效率為63％。 基因治療成為當前腫瘤治療的一個熱點。由于目前所采用的病毒載體靶向性不佳，轉(zhuǎn)染效率不高，基因?qū)梭w內(nèi)后表達水平不理想以及安全性差，在很大程度上制約了腫瘤的基因治療。 腫瘤靶向性基因-病毒療法的出現(xiàn)，為腫瘤的治療帶了新的希望。將治療基因插入到利用腫瘤特異性增殖型腺

4、病毒基因組中，以其作為輸送載體，治療基因?qū)S著病毒在腫瘤細胞內(nèi)大量增殖而高水平表達，發(fā)揮病毒溶瘤及基因治療的雙重抗腫瘤作用，從而進一步克服各自的不足。 在人類腫瘤中，有60％以上的腫瘤發(fā)生與p53基因的突變或其蛋白功能失活有關(guān)，且其突變頻率很高。因此，將野生型p53基因?qū)肽[瘤細胞，以糾正其異常功能，發(fā)揮抗腫瘤作用。 為實現(xiàn)靶向性殺傷腫瘤細胞，本課題采用了人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動子及缺氧反應元件(HRE)啟動

5、子調(diào)控的腺病毒轉(zhuǎn)移載體SG502-△CR2，將攜帶p53基因的表達盒克隆入其中，與骨架質(zhì)粒pPE3共轉(zhuǎn)染293細胞，經(jīng)同源重組獲得了雙靶向增殖型腺病毒SG502-p53。 通過細胞實驗，證實了此病毒對鼻咽癌細胞具有高度的選擇性及很強的殺傷能力，為鼻咽癌的體內(nèi)治療提供了一種新的生物學手段及實驗依據(jù)。目的：構(gòu)建攜帶p53基因的腺病毒轉(zhuǎn)移載體SG502-△CR2-ins-p53，與腺病毒骨架質(zhì)粒pPE3在293細胞中通過同源重組，獲得

6、具有表達p53基因能力的雙靶向增殖型腺病毒SG502-p53；探討此病毒對鼻咽癌細胞的殺傷效應，為鼻咽癌的體內(nèi)生物治療提供一種新的手段及實驗依據(jù)。 方法與結(jié)果： 1、攜帶p53基因的腺病毒轉(zhuǎn)移載體SG502-△CR2-ins-p53的構(gòu)建，病毒的包裝及其大量制備 由NCBI核酸數(shù)據(jù)庫，搜索出人全長p53基因序列，大小為1182bp，合成該基因。PCR體外擴增，電泳，以試劑盒回收約為1.2kb大小的DNA片段.經(jīng)E

7、coRⅠ與XbaⅠ酶切，過柱純化后，插入到pUC19/EcoRⅠ+XbaⅠ，得到pUC19-p53，經(jīng)測序，p53基因序列正確。又以EcoRⅠ和XbaⅠ酶切pUC19-p53，EcoRⅠ和NheⅠ酶切pClon16，兩者酶切產(chǎn)物相連接，得到pClon16-p53。AgeⅠ和SpeⅠ切開pClon16-p53，與AgeⅠ和XbaⅠ酶切pClon9-ins得到的ins片段相連，獲得pClon16-ins-p53。再以AgeⅠ和NotⅠ及Sc

8、aⅠ切該載體，回收大小為2449bpDNA片段。此片段即為攜帶p53基因的表達框，由ins，mCMVpromoter，p53gene和SV40poly-A組成。然后將此表達框插入經(jīng)AgeⅠ和NotⅠ酶切后的SG502-△CR2載體中，得到轉(zhuǎn)移載體SG502-△CR2-ins-p53。 將轉(zhuǎn)移載體SG502-△CR2-ins-p53與腺病毒骨架載體pPE3共轉(zhuǎn)染至293細胞內(nèi)，攜帶p53基因的表達框經(jīng)同源重組后，插入到腺病毒基因組

9、的E1區(qū)。轉(zhuǎn)染后第10天出現(xiàn)病毒空斑，顯微鏡下吸取空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化后，小量擴增，吸取上清，抽提病毒DNA。以p53基因上下游引物，進行PCR鑒定，重組正確的病毒再次感染293細胞，Elisa試劑盒檢測其表達后，病毒被命名為SG502-p53。 腺病毒SG502-p53在293細胞中大量擴增后，收集病變的293細胞。以氯化銫梯度離心法純化病毒，TCID50法測定其滴度為3.15×1010pfu/ml。 2、雙靶向

10、增殖腺病毒SG502-p53表達p53的檢測 重組腺病毒SG502-p53分別感染CNE-1，CNE-2，CNE-3及HKM-1后，WesternBlot檢測腺病毒SG502-p53在鼻咽癌細胞株中p53蛋白的表達；Elisa檢測感染此病毒的CNE-1細胞中表達的p53蛋白。結(jié)果顯示SG502-p53在鼻咽癌細胞株中均能大量表達wt-p53蛋白。 3、雙靶向增殖型腺病毒SG502-p53殺傷鼻咽癌細胞株體外實驗

11、3.1病毒增殖實驗 重組腺病毒SG502-p53以MOI值為5感染人正常肝細胞株與上述四種鼻咽癌細胞株后，TCID50法測定0h、48h和96h三個時段病毒滴度，以了解病毒在上述細胞株中的增殖情況。實驗數(shù)據(jù)表明SG502-p53在鼻咽癌細胞株中能隨時間段的增加而大量復制增殖，但在正常肝細胞中的增殖力遠遠弱于鼻咽癌細胞中的。因此，SG502-p53對鼻咽癌細胞具有高度的靶向增殖能力。 3.2細胞活力實驗(MTT)：

12、 重組腺病毒SG502-p53以不同的MOI值感染上述四種鼻咽癌細胞株，7天后加入MTT，測定其吸收值，繪制MTT曲線圖。數(shù)據(jù)顯示SG502-p53能在很小的MOI值下殺傷鼻咽癌細胞。以CNE-2及CNE-3對此病毒最為敏感，其半殺傷劑量(IC50)分別為0.22±0.02及0.31±0.03。 3.3細胞病理效應(CPE)實驗： 腺病毒SG502-p53以不同的MOI值感染上述四種鼻咽癌細胞株，7天后固定，染色。結(jié)果直

13、觀地顯示此病毒對鼻咽癌細胞株均有很強的殺傷能力。其中以CNE-2最為明顯，在MOI值僅為0.5時即可殺滅全部的CNE-2細胞。 實驗結(jié)論： 本實驗成功地構(gòu)建了攜帶p53基因的增殖型腺病毒穿梭質(zhì)粒SG502-△CR2-ins-p53；通過同源重組成功地獲得具有高效表達p53基因能力的雙靶向增殖型腺病毒載體SG502-p53；體外實驗表明重組腺病毒SG502-p53能夠選擇性地在鼻咽癌細胞中高效增殖、殺傷鼻咽癌細胞。