高氧損傷肺組織體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的研究.pdf

1、本文對(duì)高氧損傷肺組織體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化進(jìn)行了研究。文章分為兩個(gè)部分：
　　 第一章小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的體外分離擴(kuò)增及鑒定。
　　 目的：探討小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外分離、純化及鑒定的方法。
　　 方法：采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)小鼠MSCs，觀察不同代細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面抗原CD34、CD45、CD105和CD106的表達(dá)情況，并對(duì)小鼠MSCs

2、進(jìn)行純度測(cè)定。
　　 結(jié)果：小鼠MSCs原代培養(yǎng)接種24小時(shí)后僅可見(jiàn)少許細(xì)胞貼壁，72小時(shí)后貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，可見(jiàn)一些集落形成，此時(shí)貼壁的細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形。在細(xì)胞培養(yǎng)的2～6天細(xì)胞增殖較慢，7～12天細(xì)胞增殖較快，呈“旋渦樣”排列。細(xì)胞培養(yǎng)約兩周左右，可接近80％～90％融合，細(xì)胞形態(tài)較為均一。傳代后的小鼠MSCs24小時(shí)基本全部貼壁，呈梭形或星型樣形態(tài)，傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞不再以集落方式生長(zhǎng)，而呈均勻性分布生長(zhǎng)。分離純化后所得

3、細(xì)胞活力為92.6±1.8％。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示第3代小鼠MSCs細(xì)胞均一性較好，在90％以上；CD34、CD45表達(dá)陰性，CD105、CD106表達(dá)陽(yáng)性。
　　 結(jié)論：密度梯度離心法結(jié)合貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法可成功培養(yǎng)出MSCs，所得小鼠MSCs活力及純度均較高，流式細(xì)胞技術(shù)可以鑒定體外分離培養(yǎng)的小鼠MSCs。
　　 第二章肺組織與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外非接觸共培養(yǎng)。
　　 目的：建立肺組織與MSCs體外非接觸共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

4、模型，探討高氧損傷肺組織體外對(duì)MSCs分化及遷移能力的影響。
　　 方法：出生1天新生小鼠置于60％氧濃度條件下飼養(yǎng)21天，建立支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia BPD)肺損傷模型。21天時(shí)脫頸椎處死取出肺組織，無(wú)菌條件下研磨、篩網(wǎng)過(guò)濾、胰酶消化、制備成肺組織單細(xì)胞懸液。共設(shè)定3組，transwell小室(PET膜孔徑為0.4um)下室中為第三代小鼠MSCs，上室中分別隨機(jī)放入高氧損傷肺組織

5、單細(xì)胞懸液(實(shí)驗(yàn)組A)、正常肺組織單細(xì)胞懸液(實(shí)驗(yàn)組B)及空白培養(yǎng)液(對(duì)照組)，進(jìn)行體外非接觸共培養(yǎng)。共培養(yǎng)6天做劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)，觀察共培養(yǎng)后各組MSCs遷移能力的變化。共培養(yǎng)8天進(jìn)行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微下觀察各組共培養(yǎng)體系下室SP-C、AQP5免疫熒光表達(dá)情況。共培養(yǎng)8天采用實(shí)時(shí)定量(Real-time)PCR，2-△△Ct方法定量分析共培養(yǎng)體系下室MSCs中表面活性蛋白-C(SP-C)、水通道蛋白5

6、(AQP5)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)mRNA含量的表達(dá)。
　　 結(jié)果：吸入60％氧氣21天小鼠肺組織病理切片示：肺泡正常結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔直徑明顯擴(kuò)大，肺泡數(shù)量減少，可見(jiàn)大面積肺泡融合，肺泡間隔增厚，大量間質(zhì)細(xì)胞增生，BPD高氧肺損傷模型建立成功。劃痕后培養(yǎng)12小時(shí)進(jìn)行觀察，三組均僅有少量細(xì)胞爬行至劃痕中，24小時(shí)三組數(shù)目均有增加，但實(shí)驗(yàn)組A增加較明顯，48小時(shí)實(shí)驗(yàn)組B及對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)量明顯少于實(shí)驗(yàn)組A。Transwe

7、ll小室侵襲實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)48小時(shí)后，對(duì)小室下表面上的細(xì)胞計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組A與實(shí)驗(yàn)組B或?qū)φ战M相比較，穿過(guò)PET膜的細(xì)胞數(shù)目均有顯著性差異。提示損傷肺組織共培養(yǎng)可以促進(jìn)MSCs遷移能力的提高。共培養(yǎng)8天時(shí)免疫熒光結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組A組可以見(jiàn)hoechst33342標(biāo)記的藍(lán)色熒光，AQP5的紅色熒光，SP-C的綠色熒光；實(shí)驗(yàn)組B和對(duì)照組都僅見(jiàn)到hoechst33342標(biāo)記的藍(lán)色熒光，AQP5的紅色熒光，而未見(jiàn)到SP-C的綠色熒光。共培養(yǎng)8天時(shí)Rea

8、l-timePCR結(jié)果：SP-C mRNA在實(shí)驗(yàn)組A存在表達(dá)，但實(shí)驗(yàn)組B和對(duì)照組均未見(jiàn)有SP-CmRNA表達(dá)。AQP5 mRNA、TGF-β1 mRNA三組均有表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組A與實(shí)驗(yàn)組B和對(duì)照組比較AQP5、TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平明顯增加(P＜0.01)。但實(shí)驗(yàn)組B組與對(duì)照組表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：成功建立BPD高氧肺損傷模型，以及體外非接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠MSCs分化為肺泡上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?/p>