損傷性腎勻漿體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：急性腎損傷是多種原因引起的以腎功能驟然下降為表現(xiàn)的臨床綜合征,目前尚無有效地針對(duì)病因的治療方法。急性腎損傷主要病理損害為急性腎小管壞死。因此，如何減輕腎小管的壞死、恢復(fù)腎小管的結(jié)構(gòu)和功能成為治療AKI的要點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的潛能，有研究報(bào)道外源性BMSCs可以歸巢至損傷腎臟并轉(zhuǎn)分化為腎小管上皮細(xì)胞，從而減輕腎臟結(jié)構(gòu)及功能的損傷。在體外研究中，利用急性腎損傷的微環(huán)境，也可以誘導(dǎo)BMSCs向腎小管上皮樣細(xì)胞分化。另外，還

2、有研究報(bào)道在BMSC修復(fù)損傷腎臟的過程中發(fā)現(xiàn)有多種細(xì)胞因子參與其過程，這也可能是其進(jìn)行組織修復(fù)的機(jī)制之一。細(xì)胞角蛋白是上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記，腎小管上皮細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)細(xì)胞角蛋白18型（CK-18）；在急性腎損傷時(shí)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）及其受體C-met表達(dá)增高，可以抑制細(xì)胞凋亡、減輕小管壞死、加速腎小管上皮細(xì)胞增殖，減輕腎小管損傷；骨形成蛋白（BMP-7）是一個(gè)重要的抑制纖維化的細(xì)胞因子，能夠拮抗TGF-β的促纖維化作用，調(diào)控炎癥因子表達(dá)

3、，維持腎小管上皮細(xì)胞表型，具有腎臟保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)擬通過大鼠缺血再灌注損傷性腎勻漿在體外模擬急性腎損傷的微環(huán)境，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞CK-18的表達(dá)；同時(shí)檢測(cè)腎臟保護(hù)相關(guān)因子HGF、BMP-7的表達(dá)，進(jìn)而探討B(tài)MSCs對(duì)損傷腎臟修復(fù)的可能機(jī)制。
　　方法：體外分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs，流式細(xì)胞儀對(duì)第三代細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)志物（CD73、CD105）的鑒定；取鑒定后的第三代BMSCs，分別用DMEM/F12培養(yǎng)液

4、+10％胎牛血清（對(duì)照組）；DMEM/F12培養(yǎng)液+10%胎牛血清+5μmol/L全反式維甲酸+10%大鼠缺血再灌注損傷腎臟組織勻漿上清液（誘導(dǎo)組）做體外細(xì)胞培養(yǎng)。7天后倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變、蛋白免疫印跡法檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞角蛋白18(CK-18)的表達(dá)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）的mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：成功分離、培養(yǎng)大鼠 BMSCs，流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型

5、 CD73陽性率95.8%，CD105陽性率94.5%；經(jīng)缺血再灌注損傷大鼠腎臟勻漿誘導(dǎo)后7天，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形部分變?yōu)槎趟笮?、不?guī)則形；Western Blot檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞CK-18的表達(dá)陽性，明顯高于對(duì)照組（P<0.05）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HGF、BMP-7的mRNA表達(dá)誘導(dǎo)組明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。
　　結(jié)論：⑴缺血再灌注損傷大鼠腎臟勻漿在體外可以誘導(dǎo)部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腎小管上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，