非受體型酪氨酸激酶TEC在LPS誘導巨噬細胞促炎性細胞因子產生中的作用.pdf

1、一、研究背景：
　　膿毒癥(sepsis)是感染、休克、嚴重創(chuàng)傷和外科大手術患者常見的并發(fā)癥，可進一步發(fā)展為膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)等，甚至死亡，是危重病患者的最主要死亡原因之一。膿毒癥的本質是感染所引起的失控的全身性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory responsesyndrome，SIRS)，通過各種炎癥介質過

2、度釋放，引起廣泛的自身細胞和組織損傷以及多器官功能障礙。近年來學術界對SIRS的機制已獲得共識：SIRS是機體非特異性免疫系統(tǒng)（特別是單核－巨噬細胞）對細菌內毒素及其致炎物質的過度反應。
　　Tec(Tyrosine kinase expressed in hepatocelluar carcinoma)是1990年Mano等在研究肝癌時，在肝癌組織中篩選得到的、起重要作用的一種酪氨酸蛋白激酶基因。其是一種重要的非受體型蛋白酪氨酸

3、激酶，存在于胞質內，主要在肝臟、T細胞、B細胞、造血細胞等中表達，主要與GM-CSF、EPO、EGF、IL-6等細胞因子介導的信號轉導途徑密切相關，參與對血細胞尤其是B淋巴細胞和T淋巴細胞的增殖與分化，并在肝細胞增殖中發(fā)揮著重要的調控作用。近幾年國內外很多研究發(fā)現(xiàn)，它也參與一些類風濕性關節(jié)炎等慢性炎癥相關性疾病的炎癥反應過程。綜上，Tec家族激酶可能與炎癥過程有著密切的關系，且有一些重要問題未被闡明。
　　本實驗采用RAW264.

4、7單核巨噬細胞為研究對象,觀察膿毒癥時巨噬細胞TEC的表達及活化規(guī)律,并使用TEC激酶特異性抑制劑LFM-A13進行干預,觀察TEC激酶在巨噬細胞促炎性細胞因子TNF-α和IL-1β產生中的作用,以了解TEC激酶在膿毒癥時巨噬細胞炎癥介質產生中的作用和機制,以進一步了解膿毒癥的發(fā)生機制并為其防治提供新的思路和方法。
　　二、研究目的：
　　1.探討LPS對RAW264.7巨噬細胞TEC激酶表達及TEC激酶磷酸化水平的影響。<

5、br>　　2.研究TEC激酶在RAW264.7巨噬細胞促炎性細胞因子TNF-a和IL-1β產生中的作用。
　　三、研究內容
　　第一部分LPS對RAW264.7巨噬細胞TEC激酶表達的影響
　　小鼠RAW264.7單核巨噬細胞常規(guī)培養(yǎng)后分劑量效應和時間效應兩方面進行研究。(l)劑量效應研究:加入不同濃度的lps(0.01,0.1,1,10,100ug/ml)刺激24h。(2)時間效應研究:加入0.1ug/ml的lps分

6、別刺激0,15min，30min，45min，60min和120min;采用Western Blot法聯(lián)合免疫沉淀法檢測細胞TEC激酶的表達和TEC激酶磷酸化水平。
　　第二部分TEC激酶在LPS誘導巨噬細胞促炎性細胞因子產生中的作用
　　按照隨機數(shù)字表法將培養(yǎng)于6孔板的RAW264.7巨噬細胞分為4組，每組8孔細胞。包括：
　?。?）空白對照組:：采用含體積分數(shù)10％FBS的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)2 h；
　　

7、（2）LFM-A13組：預先用75μmol/L的TEC激酶特異性抑制劑LFM-A13預處理細胞1 h，再常規(guī)培養(yǎng)1 h；
　　（3）LPS組：采用含體積分數(shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)1 h，再用0.1μg/mL LPS刺激1 h；
　　（4）LPS+LFM-A13組：預先用75μmol/L的LFM-A13處理細胞1 h，再用0.1μg/ml LPS刺激1 h。采用ELISA法測定各組培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-1

8、β的含量；實時熒光定量PCR檢測細胞內TNF-α和IL-1βmRNA的表達；蛋白印跡法檢測細胞內TEC激酶、轉化生長因子激活激酶（TAK1）和p38 MAPK的活性。
　　四、研究結果：
　　第一部分
　　Western Blot結果顯示：
　　（1）LPS誘導RAW264.7單核巨噬細胞TEC激酶的表達表達呈劑量依賴性,在一定范圍內(<1ug/ml),隨LPS濃度的增加,巨噬細胞TEC激酶的表達逐漸增強,LPS

9、為1ug/ml孵育24h時誘導TEC激酶表達達到高峰,但高濃度(>1ug/ml)時LPS的刺激效應逐漸降低。
　?。?）LPS(O.1ug/ml)誘導RAW264.7單核巨噬細胞TEC激酶磷酸化水平呈時間依賴性,孵育15min后,巨噬細胞TEC激酶磷酸化水平開始上升,在60min達到最高峰,隨后下降。
　　第二部分
　　ELISA、Real-time PCR和Western Blot結果顯示：LFM-A13組培養(yǎng)上清液

10、中的TNF-α、IL-1β含量分別為329±41、220±27，與空白對照組的330±44、211±31接近（P值均大于0.05）；其TNF-α、IL-1βmRNA含量分別為0.92±0.13、0.98±0.13，與空白對照組的1.00±0.18、1.00±0.19接近（P值均大于0.05）。LPS組細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α、IL-1β含量分別為（1213±154）、（636±90）pg/mL，均顯著高于空白對照組（P值均小于0.0

11、1）；其細胞內的TNF-α和IL-1β mRNA表達分別為1.57±0.22、1.44±0.24，均顯著高于空白對照組（P值均小于0.01）。LPS+LFM-A13組上清液中的TNF-α、IL-1β含量分別為（787±109）、（453±64）pg/mL，顯著低于LPS組（P值均小于0.05）；其細胞內TNF-α和IL-1βmRNA表達分別為1.21±0.15、1.21±0.22，也顯著低于LPS組（P值均小于0.05）。LPS組細胞內

12、TEC、TAK1和p38 MAPK活性表達分別為2.69±0.41、3.99±0.65、2.07±0.31，均明顯高于空白對照組的1.00±0.17、1.00±0.16、1.00±0.18（P值均小于0.01）；LPS+LFM-A13組細胞內TEC、TAK1和p38 MAPK活性表達（分別為1.02±0.17、1.18±0.20、1.58±0.28）亦較LPS組顯著下降（P<0.05或P<0.01）。
　　五、研究結論：