非受體型酪氨酸激酶TEC在LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生中的作用.pdf

1、一、研究背景：
　　膿毒癥(sepsis)是感染、休克、嚴(yán)重創(chuàng)傷和外科大手術(shù)患者常見的并發(fā)癥，可進(jìn)一步發(fā)展為膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)等，甚至死亡，是危重病患者的最主要死亡原因之一。膿毒癥的本質(zhì)是感染所引起的失控的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory responsesyndrome，SIRS)，通過各種炎癥介質(zhì)過

2、度釋放，引起廣泛的自身細(xì)胞和組織損傷以及多器官功能障礙。近年來學(xué)術(shù)界對SIRS的機(jī)制已獲得共識(shí)：SIRS是機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)（特別是單核－巨噬細(xì)胞）對細(xì)菌內(nèi)毒素及其致炎物質(zhì)的過度反應(yīng)。
　　Tec(Tyrosine kinase expressed in hepatocelluar carcinoma)是1990年Mano等在研究肝癌時(shí)，在肝癌組織中篩選得到的、起重要作用的一種酪氨酸蛋白激酶基因。其是一種重要的非受體型蛋白酪氨酸

3、激酶，存在于胞質(zhì)內(nèi)，主要在肝臟、T細(xì)胞、B細(xì)胞、造血細(xì)胞等中表達(dá)，主要與GM-CSF、EPO、EGF、IL-6等細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑密切相關(guān)，參與對血細(xì)胞尤其是B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的增殖與分化，并在肝細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。近幾年國內(nèi)外很多研究發(fā)現(xiàn)，它也參與一些類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥相關(guān)性疾病的炎癥反應(yīng)過程。綜上，Tec家族激酶可能與炎癥過程有著密切的關(guān)系，且有一些重要問題未被闡明。
　　本實(shí)驗(yàn)采用RAW264.

4、7單核巨噬細(xì)胞為研究對象,觀察膿毒癥時(shí)巨噬細(xì)胞TEC的表達(dá)及活化規(guī)律,并使用TEC激酶特異性抑制劑LFM-A13進(jìn)行干預(yù),觀察TEC激酶在巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β產(chǎn)生中的作用,以了解TEC激酶在膿毒癥時(shí)巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)產(chǎn)生中的作用和機(jī)制,以進(jìn)一步了解膿毒癥的發(fā)生機(jī)制并為其防治提供新的思路和方法。
　　二、研究目的：
　　1.探討LPS對RAW264.7巨噬細(xì)胞TEC激酶表達(dá)及TEC激酶磷酸化水平的影響。<

5、br>　　2.研究TEC激酶在RAW264.7巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子TNF-a和IL-1β產(chǎn)生中的作用。
　　三、研究內(nèi)容
　　第一部分LPS對RAW264.7巨噬細(xì)胞TEC激酶表達(dá)的影響
　　小鼠RAW264.7單核巨噬細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后分劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)兩方面進(jìn)行研究。(l)劑量效應(yīng)研究:加入不同濃度的lps(0.01,0.1,1,10,100ug/ml)刺激24h。(2)時(shí)間效應(yīng)研究:加入0.1ug/ml的lps分

6、別刺激0,15min，30min，45min，60min和120min;采用Western Blot法聯(lián)合免疫沉淀法檢測細(xì)胞TEC激酶的表達(dá)和TEC激酶磷酸化水平。
　　第二部分TEC激酶在LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生中的作用
　　按照隨機(jī)數(shù)字表法將培養(yǎng)于6孔板的RAW264.7巨噬細(xì)胞分為4組，每組8孔細(xì)胞。包括：
　?。?）空白對照組:：采用含體積分?jǐn)?shù)10％FBS的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)2 h；
　　

7、（2）LFM-A13組：預(yù)先用75μmol/L的TEC激酶特異性抑制劑LFM-A13預(yù)處理細(xì)胞1 h，再常規(guī)培養(yǎng)1 h；
　?。?）LPS組：采用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)1 h，再用0.1μg/mL LPS刺激1 h；
　?。?）LPS+LFM-A13組：預(yù)先用75μmol/L的LFM-A13處理細(xì)胞1 h，再用0.1μg/ml LPS刺激1 h。采用ELISA法測定各組培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-1

8、β的含量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-1βmRNA的表達(dá)；蛋白印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)TEC激酶、轉(zhuǎn)化生長因子激活激酶（TAK1）和p38 MAPK的活性。
　　四、研究結(jié)果：
　　第一部分
　　Western Blot結(jié)果顯示：
　?。?）LPS誘導(dǎo)RAW264.7單核巨噬細(xì)胞TEC激酶的表達(dá)表達(dá)呈劑量依賴性,在一定范圍內(nèi)(<1ug/ml),隨LPS濃度的增加,巨噬細(xì)胞TEC激酶的表達(dá)逐漸增強(qiáng),LPS

9、為1ug/ml孵育24h時(shí)誘導(dǎo)TEC激酶表達(dá)達(dá)到高峰,但高濃度(>1ug/ml)時(shí)LPS的刺激效應(yīng)逐漸降低。
　?。?）LPS(O.1ug/ml)誘導(dǎo)RAW264.7單核巨噬細(xì)胞TEC激酶磷酸化水平呈時(shí)間依賴性,孵育15min后,巨噬細(xì)胞TEC激酶磷酸化水平開始上升,在60min達(dá)到最高峰,隨后下降。
　　第二部分
　　ELISA、Real-time PCR和Western Blot結(jié)果顯示：LFM-A13組培養(yǎng)上清液

10、中的TNF-α、IL-1β含量分別為329±41、220±27，與空白對照組的330±44、211±31接近（P值均大于0.05）；其TNF-α、IL-1βmRNA含量分別為0.92±0.13、0.98±0.13，與空白對照組的1.00±0.18、1.00±0.19接近（P值均大于0.05）。LPS組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α、IL-1β含量分別為（1213±154）、（636±90）pg/mL，均顯著高于空白對照組（P值均小于0.0

11、1）；其細(xì)胞內(nèi)的TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)分別為1.57±0.22、1.44±0.24，均顯著高于空白對照組（P值均小于0.01）。LPS+LFM-A13組上清液中的TNF-α、IL-1β含量分別為（787±109）、（453±64）pg/mL，顯著低于LPS組（P值均小于0.05）；其細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)分別為1.21±0.15、1.21±0.22，也顯著低于LPS組（P值均小于0.05）。LPS組細(xì)胞內(nèi)

12、TEC、TAK1和p38 MAPK活性表達(dá)分別為2.69±0.41、3.99±0.65、2.07±0.31，均明顯高于空白對照組的1.00±0.17、1.00±0.16、1.00±0.18（P值均小于0.01）；LPS+LFM-A13組細(xì)胞內(nèi)TEC、TAK1和p38 MAPK活性表達(dá)（分別為1.02±0.17、1.18±0.20、1.58±0.28）亦較LPS組顯著下降（P<0.05或P<0.01）。
　　五、研究結(jié)論：