異基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞早期局部移植修復(fù)堿燒傷角膜的研究.pdf

1、目的：進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，MMSCs)的分離、純化和鑒定；研究MMSCs同種異基因移植后的生存狀況和對(duì)受體免疫狀態(tài)的影響，探討局部結(jié)膜下行MMSCs異基因移植用于治療眼表創(chuàng)傷疾病的可行性；研究局部結(jié)膜下行MMSCs異基因移植修復(fù)中、重度堿燒傷角膜的可行性，并探討其可能的發(fā)生機(jī)制。 方法： 1.幼年SD大鼠10只。采用貼壁篩選法分離SD

2、大鼠骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞，反復(fù)傳代對(duì)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增、純化。鑒定：顯微鏡下觀察各代細(xì)胞的形態(tài)、排列形式；選擇第三代貼壁細(xì)胞，誘導(dǎo)其向脂肪樣細(xì)胞、骨樣細(xì)胞分化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面的免疫分子CD29、CD44、CD90、CD31、CD34、CD45的表達(dá)。 2.成年SD大鼠20只，MMSCs移植組10只，培養(yǎng)液對(duì)照組10只。體外DiI熒光標(biāo)記MMSCs。表面麻醉下在鼻側(cè)、顳側(cè)結(jié)膜下各注入100μl的DiI-MMSCs細(xì)胞懸液，密度為5

3、×103個(gè)/μl；對(duì)照組10只，同樣方法注入200μL的DMEM-F12培養(yǎng)液。移植后4周共聚焦熒光顯微鏡下(DAPI復(fù)染細(xì)胞核)追蹤MMSCs在體內(nèi)存活情況，觀察受體鼠生長(zhǎng)狀況和角膜、虹膜、晶體等眼部情況，RT-PCR法比較兩組大鼠角膜免疫分子MHC-II的mRNA的表達(dá)差異。 3.建立中度和重度角膜堿燒傷模型。中度角膜堿燒傷的MMSCs移植分組：模型+MMSCs移植組40只(其中CM-DiI標(biāo)記的MMSC移植為10只)，燒傷

4、后1小時(shí)移植，細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/μl；模型+培養(yǎng)液組(對(duì)照組)30只。移植后3天、2周、4周觀察角膜透明度、新生血管。移植后4周行角膜組織HE染色、免疫熒光法共聚焦顯微鏡下觀察MMSCs的遷移，角膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記CK12、Cx43的表達(dá)及分布。RT-PCR法檢測(cè)EGF、IL-RA的表達(dá)。Westernblotting分析E-cadherin的表達(dá)。 重度角膜堿燒傷的MMSCs移植分組：模型+MMSC移植組28只(其中C

5、M-DiI熒光標(biāo)記MMSCs移植為10只)；模型+培養(yǎng)液組(對(duì)照組)18只。移植后3天、2周、4周觀察角膜透明度、新生血管。移植后4周行角膜組織HE染色、免疫熒光法共聚焦顯微鏡下觀察角膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記CK12、Cx43的表達(dá)及分布。RT-PCR分析IL-1RA的表達(dá)。 結(jié)果： 1.貼壁細(xì)胞呈間質(zhì)細(xì)胞特性：呈梭形，漩渦狀排列。VonKossa染色、油紅染色貼壁細(xì)胞呈骨樣細(xì)胞及脂肪樣細(xì)胞分化。流式細(xì)胞儀顯示細(xì)胞表面的免疫

6、分子的表達(dá)：CD29(99.19％)、CD44(98.34％)、CD90(97.94％)；CD31(0.15％)、CD34(0.69％)、CD45(1.21％)。 2.移植4周后大量的DiI-MMSCs存活于結(jié)膜下、角膜緣，結(jié)構(gòu)完整，生長(zhǎng)良好。受體鼠全身情況良好，眼局部無排斥反應(yīng)發(fā)生。RT-PCR結(jié)果顯示受體鼠角膜表達(dá)MHC-II，對(duì)照組未表達(dá)。 3.中度角膜堿燒傷的MMSCs移植結(jié)果：與對(duì)照組比較，移植后2周、4周移植

7、組角膜透明度改善(P<0.05)、新生血管減少(P<0.05)。HE染色顯示角膜上皮層有3-4層細(xì)胞，基質(zhì)層可見少量新生血管，炎性細(xì)胞。共聚焦顯微鏡下見角膜緣處DiI-MMSCs少量表達(dá)CK12、Cx43；近角膜中央處存在MMSCs，未表達(dá)CK12、Cx43；角膜中央未見MMSCs。2周和4周時(shí)移植組EGF、IL-1RA高表達(dá)，其中2周時(shí)EGF的表達(dá)和IL-1RA的表達(dá)差異明顯。4周時(shí)E-cadherin低表達(dá)，3天和2周時(shí)未見表達(dá)E-

8、cadherin。 重度角膜堿燒傷的MMSCs移植結(jié)果：與對(duì)照組比較，4周時(shí)移植組角膜新生血管減少(P<0.05)，而透明度未見改善。HE染色顯示上皮層中少量基底細(xì)胞，新生血管較少，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。共聚焦熒光顯微鏡下見角膜緣處少量DiI-MMSCs，未表達(dá)CK12、Cx43。角膜近中央?yún)^(qū)和中央?yún)^(qū)未見遷移的MMSCs。RT-PCR顯示，移植組2周、4周時(shí)IL-1RA高表達(dá)，其中2周時(shí)差異明顯。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)從

9、骨髓中分離的貼壁細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，純度高。貼壁篩選和反復(fù)傳代法是一種較理想的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提純方法。 2.局部結(jié)膜下行MMSCs異基因移植用于治療眼表創(chuàng)傷疾病是安全可行的，有利于創(chuàng)建一種細(xì)胞來源廣泛、無免疫排斥、微創(chuàng)的治療眼表創(chuàng)傷疾病的新手段。 3.早期局部結(jié)膜下行異基因MMSCs移植可以抑止堿燒傷角膜表面新生血管生成，促進(jìn)中度堿燒傷角膜修復(fù)。MMSCs發(fā)生遷移和分化，取決于局部微環(huán)境的改變。MMSCs的作用機(jī)