AQPl-shRNA重組腺病毒質粒功能鑒定.pdf

1、水通道蛋白（AQPs）是細胞膜上特異性轉運水的孔道。之前的研究表明AQP1普遍表達于腫瘤血管內皮，并且在其他的許多腫瘤細胞中也有表達。但是，其表達是否是一種異?，F(xiàn)象，或者其在腫瘤生物學中是否為關鍵因素，這些在AQPs的表達研究中仍不清楚。
　　 對于水通道蛋白1（AQP1）的研究歷史短暫，現(xiàn)在對于它的研究還不能完全表明其在機體內的作用機制。本研究構建AQP1的shRNA的腺病毒質粒，并利用AQP1-shRNA重組腺病毒質粒干涉內

2、源性表達的AQP1及外源性表達的AQP1，研究了AQP1和細胞水轉運功能和細胞運動性之間的關系。
　　 首先采用包括入門載體pENTR2B和目的載體pAd/CMV/V5-DEST在內的腺病毒載體系統(tǒng)，并利用DNA重組技術以及LR反應構建AQP1-shRNA重組腺病毒質粒，再使用雙抗生素篩選、不同感受態(tài)細胞轉化篩選以及限制性內切酶酶切鑒定其正確性。
　　 然后將分子水平鑒定正確的AQP1-shRNA重組腺病毒質粒轉染到表達

3、外源性AQP1的CHO細胞以及表達內源性AQP1的肝癌細胞SMMC7221中，并通過 Western blot實驗和免疫熒光實驗對AQP1-shRNA重組腺病毒質粒進行功能鑒定，結果證明AQP1-shRNA重組腺病毒質粒不僅可以沉默外源性的hAQP1還可以沉默內源性hAQP1基因表達，并且以第二個質粒即hAQP1-shRNA2沉默效果最為顯著。
　　 之后利用MTT實驗、細胞膜水通透性實驗、劃痕實驗以及Western blot實

4、驗研究轉染AQP1-shRNA重組腺病毒質粒后通過沉默外源性AQP1以及內源性AQP1表達進而研究AQP1和細胞水轉運功能以及細胞運動性的關系，結果說明AQP1-shRNA重組腺病毒質粒既可以顯著干涉CHO細胞中外源性AQP1對水的通透性，又可以干涉肝癌細胞SMMC7221中內源性糖基化的AQP1對水的通透性，并且AQP1-shRNA重組腺病毒質粒沉默AQP1后，細胞運動性受到顯著地抑制，同時AQP1可能通過細胞骨架的重建修復來參與細胞