AQPl-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒功能鑒定.pdf

1、水通道蛋白（AQPs）是細(xì)胞膜上特異性轉(zhuǎn)運(yùn)水的孔道。之前的研究表明AQP1普遍表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮，并且在其他的許多腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)。但是，其表達(dá)是否是一種異?，F(xiàn)象，或者其在腫瘤生物學(xué)中是否為關(guān)鍵因素，這些在AQPs的表達(dá)研究中仍不清楚。
　　 對于水通道蛋白1（AQP1）的研究歷史短暫，現(xiàn)在對于它的研究還不能完全表明其在機(jī)體內(nèi)的作用機(jī)制。本研究構(gòu)建AQP1的shRNA的腺病毒質(zhì)粒，并利用AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒干涉內(nèi)

2、源性表達(dá)的AQP1及外源性表達(dá)的AQP1，研究了AQP1和細(xì)胞水轉(zhuǎn)運(yùn)功能和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性之間的關(guān)系。
　　 首先采用包括入門載體pENTR2B和目的載體pAd/CMV/V5-DEST在內(nèi)的腺病毒載體系統(tǒng)，并利用DNA重組技術(shù)以及LR反應(yīng)構(gòu)建AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒，再使用雙抗生素篩選、不同感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化篩選以及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定其正確性。
　　 然后將分子水平鑒定正確的AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到表達(dá)

3、外源性AQP1的CHO細(xì)胞以及表達(dá)內(nèi)源性AQP1的肝癌細(xì)胞SMMC7221中，并通過 Western blot實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)對AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)行功能鑒定，結(jié)果證明AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒不僅可以沉默外源性的hAQP1還可以沉默內(nèi)源性hAQP1基因表達(dá)，并且以第二個(gè)質(zhì)粒即hAQP1-shRNA2沉默效果最為顯著。
　　 之后利用MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞膜水通透性實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)以及Western blot實(shí)

4、驗(yàn)研究轉(zhuǎn)染AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒后通過沉默外源性AQP1以及內(nèi)源性AQP1表達(dá)進(jìn)而研究AQP1和細(xì)胞水轉(zhuǎn)運(yùn)功能以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的關(guān)系，結(jié)果說明AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒既可以顯著干涉CHO細(xì)胞中外源性AQP1對水的通透性，又可以干涉肝癌細(xì)胞SMMC7221中內(nèi)源性糖基化的AQP1對水的通透性，并且AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒沉默AQP1后，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性受到顯著地抑制，同時(shí)AQP1可能通過細(xì)胞骨架的重建修復(fù)來參與細(xì)胞