AQPl-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒功能鑒定.pdf

1、水通道蛋白（AQPs）是細胞膜上特異性轉(zhuǎn)運水的孔道。之前的研究表明AQP1普遍表達于腫瘤血管內(nèi)皮，并且在其他的許多腫瘤細胞中也有表達。但是，其表達是否是一種異?，F(xiàn)象，或者其在腫瘤生物學(xué)中是否為關(guān)鍵因素，這些在AQPs的表達研究中仍不清楚。
　　 對于水通道蛋白1（AQP1）的研究歷史短暫，現(xiàn)在對于它的研究還不能完全表明其在機體內(nèi)的作用機制。本研究構(gòu)建AQP1的shRNA的腺病毒質(zhì)粒，并利用AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒干涉內(nèi)

2、源性表達的AQP1及外源性表達的AQP1，研究了AQP1和細胞水轉(zhuǎn)運功能和細胞運動性之間的關(guān)系。
　　 首先采用包括入門載體pENTR2B和目的載體pAd/CMV/V5-DEST在內(nèi)的腺病毒載體系統(tǒng)，并利用DNA重組技術(shù)以及LR反應(yīng)構(gòu)建AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒，再使用雙抗生素篩選、不同感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化篩選以及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定其正確性。
　　 然后將分子水平鑒定正確的AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到表達

3、外源性AQP1的CHO細胞以及表達內(nèi)源性AQP1的肝癌細胞SMMC7221中，并通過 Western blot實驗和免疫熒光實驗對AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒進行功能鑒定，結(jié)果證明AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒不僅可以沉默外源性的hAQP1還可以沉默內(nèi)源性hAQP1基因表達，并且以第二個質(zhì)粒即hAQP1-shRNA2沉默效果最為顯著。
　　 之后利用MTT實驗、細胞膜水通透性實驗、劃痕實驗以及Western blot實

4、驗研究轉(zhuǎn)染AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒后通過沉默外源性AQP1以及內(nèi)源性AQP1表達進而研究AQP1和細胞水轉(zhuǎn)運功能以及細胞運動性的關(guān)系，結(jié)果說明AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒既可以顯著干涉CHO細胞中外源性AQP1對水的通透性，又可以干涉肝癌細胞SMMC7221中內(nèi)源性糖基化的AQP1對水的通透性，并且AQP1-shRNA重組腺病毒質(zhì)粒沉默AQP1后，細胞運動性受到顯著地抑制，同時AQP1可能通過細胞骨架的重建修復(fù)來參與細胞