攜帶血管生成素-1基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、目的：(1)構(gòu)建攜帶SD大鼠血管生成素-1(ang-1)基因的重組腺病毒載體并鑒定；(2)檢測ang-1基因轉(zhuǎn)染對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的影響。
　　 方法：(1)提取SD大鼠總RNA，通過RT-PCR獲取ang-1基因，亞克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV并經(jīng)測序無誤后線性化，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組。經(jīng)抗性篩選及酶切鑒定后，于工程菌XL10-Gold內(nèi)大量擴(kuò)增

2、，抽提質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝擴(kuò)增，通過載體系統(tǒng)自帶報告基因GFP(Green fluorescence protein，GFP)檢測感染效率和病毒滴度；(2)分離純化SD大鼠BMSCs并體外擴(kuò)增。通過腺病毒載體介導(dǎo)ang-1基因轉(zhuǎn)染BMSCs，分別通過熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后BMSCs中ANG-1的表達(dá)。通過MTT法評估常氧及缺氧環(huán)境下ANG-1對BMSCs的影響。
　　 結(jié)果：RT

3、-PCR獲得SD大鼠ang-1目的基因片段，重組腺病毒載體pAdEasy-卜ang-1經(jīng)測序及酶切鑒定正確，病毒滴度為2.44×109 U/m1；(2)從SD大鼠骨髓提取物中分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)為梭形，呈鋪路石狀、漩渦狀生長，并經(jīng)流式細(xì)胞儀及多向誘導(dǎo)能力檢測符合BMSCs的特征。經(jīng)轉(zhuǎn)染ang-1基因后，BMSCs表達(dá)ANG-1。MTT法檢測轉(zhuǎn)染ang-1基因后，BMSCs活性未見顯著變化。(缺氧組與缺氧下轉(zhuǎn)染組相比，P＞0.05；常氧組與