雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因重組雞痘病毒質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、1.將雞痘病毒疫苗毒接種雞胚成纖維細胞，收獲病變細胞，提取雞痘病毒DNA。根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的雞痘病毒基因序列，設(shè)計兩對引物用于擴增大小分別為1600bp和1800bp的FPV1和FPV2目的基因片段。于9～11日齡SPF雞胚上增殖純化雞傳染性喉氣管炎病毒疫苗毒，根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的ILTV基因序列設(shè)計一對能擴增2700bp的gB目的基因片段。設(shè)計一對引物，從質(zhì)粒EGFP中擴增大小約為750bp的GFP目的基因片段。

2、將獲得的四個目的基因分別克隆到pMD19-T simple vector上，篩選陽性克隆進行序列分析。結(jié)果表明:獲得的目的基因片斷序列分別與標(biāo)準(zhǔn)株序列相符，可以用于下一步構(gòu)建雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因重組雞痘病毒質(zhì)粒的試驗。
　　 2.將測序完的FPV1和FPV2分別克隆到pUC19和pSK質(zhì)粒中，并命名為pFP1和pFP2。將測序后的gB基因酶切后克隆到質(zhì)粒pFP1中獲得重組質(zhì)粒pFP1-gB;將測序后的GFP基因酶切后克隆

3、到質(zhì)粒pFP2中，得到重組質(zhì)粒pFP2-GFP。雙酶切pFP1-gB得到FP1-gB片段，并克隆到質(zhì)粒pFP2-GFP中，得到重組質(zhì)粒pFP1gB-FP2GPF。酶切質(zhì)粒pE/L-7.5，獲得背向連接的2個雞痘病毒啟動子片段-PE/L-7.5，并將該片段克隆到重組質(zhì)粒pFP1gB-FP2GFP獲得重組質(zhì)粒pgB-GFP，該質(zhì)粒即為雞痘病毒的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。在質(zhì)粒pgB-GFP中，2個背向連接的啟動子被克隆到gB和GFP基因之間，分別啟動gB和