基于細胞色素P450代謝酶的間尼索地平代謝轉(zhuǎn)化及藥物-藥物相互作用(DDI)研究.pdf

1、間尼索地平(m-nisoldipine)[化學名稱：1,4-二氫-2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-3,5-吡啶二羧酸甲酯異丁酯]是由河北醫(yī)科大學藥學院首次合成，具有自主知識產(chǎn)權(quán)的一類新型二氫吡啶類藥物，存在一個手性中心，可拆分為兩個光學對映體（R,S-m-nisoldipine）。藥理學實驗表明，該化合物具有抑制血管平滑肌收縮和擴張血管的藥理活性，在心血管系統(tǒng)和血流動力學方面表現(xiàn)出顯著的療效。前期藥代動力學實驗表明，僅有少量原型藥

2、物經(jīng)糞便和膽汁排泄，且尿中未檢出，提示間尼索地平主要以代謝物的形式排出體外，原型藥物排泄較少，此外目前的研究主要針對的是間尼索地平的消旋體，而對其對映體較少涉及。因此有必要對間尼索地平及其手性對映體的體內(nèi)外代謝情況進行系統(tǒng)的研究。
　　肝臟是體內(nèi)Ⅰ相和Ⅱ相代謝的最主要器官，是藥物體內(nèi)處置的重要場所。由于肝臟中的細胞色素CYP450酶是參與藥物代謝和生物活化的主要酶類，因此藥物與 CYP450酶相互作用的研究，以及藥物對于 CYP4

3、50酶的影響的研究就變得很有必要，同時該類研究也為藥物聯(lián)合治療的作用機制研究提供了理論依據(jù)。由于大部分藥物經(jīng)由CYP450代謝，當藥物聯(lián)合應用時發(fā)生的藥物相互作用是由于一種藥物通過誘導或抑制酶特定的亞型，從而影響了另一種藥物的代謝特征，導致藥物的相互作用。因此對于一種新化學實體而言，有必要對此方面進行研究，而間尼索地平在此方面的相關(guān)研究尚屬空白。
　　由于HPLC/MS的高靈敏度和高選擇性，該方法被廣泛應用于藥物在體內(nèi)的定量和定性

4、分析研究。鑒于藥物代謝本身的復雜性及其潛在的藥物-藥物相互作用，HPLC/MS方法已成為主要的藥代動力學和CYP450酶的研究手段。
　　本研究基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和多種體內(nèi)外模型，系統(tǒng)研究間尼索地平及其光學對映體的體內(nèi)外代謝輪廓及其代謝表型；采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)及實時定量聚合酶鏈式反應技術(shù)，借助本研究建立的特異性體外CYP450酶探針檢測方法，基于人肝癌細胞系HepG2和人肝微粒體代謝模型，系統(tǒng)分析了基于CYP450

5、酶的間尼索地平手性對映體潛在的藥物-藥物相互作用（DDI）；采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)，以大鼠作為研究對象，通過本研究建立的體內(nèi)CYP450酶探針檢測方法，系統(tǒng)分析了在不同劑量下，長期給予間尼索地平對肝藥酶的影響。
　　第一部分基于HPLC-Q-TRAP/MS技術(shù)的間尼索地平對映體的代謝表型研究
　　目的：本研究基于高效液相色譜-四級桿-線性離子阱質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)（HPLC-Q-TRAP/MS），采用CYP450酶亞型選擇性抑制

6、劑，研究主要參與間尼索地平對映體在大鼠肝微粒體中代謝轉(zhuǎn)化的CYP450酶亞型。
　　方法：將間尼索地平和CYP450酶各亞型特異性抑制劑加入大鼠肝微粒體溫孵液中共孵育，溫孵條件基于前期報道并進行優(yōu)化，溫孵一定時間后，通過與不加入化學抑制劑的陰性對照溶液比較，檢測間尼索地平對映體的剩余量，考察化學抑制劑對間尼索地平對映體代謝的影響。
　　結(jié)果：酮康唑（CYP3A特異性抑制劑）能顯著的抑制R,S兩種間尼索地平對映體的代謝，當其濃

7、度達到100μmol/L，對兩種間尼索地平對映體代謝的抑制率均達到最大，而其他CYP450特異性抑制劑對間尼索地平對映體的代謝均無明顯的抑制作用。
　　結(jié)論：實驗結(jié)果表明在大鼠肝微粒體中，CYP3A為間尼索地平對映體的主要代謝酶。
　　第二部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)的間尼索地平對映體體外代謝研究
　　目的：基于超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)（UHPLC-Q-TOF），采用大鼠肝微粒體作

8、為體外代謝反應模型，探討間尼索地平對映體的體外代謝轉(zhuǎn)化過程。
　　方法：將同等濃度的間尼索地平 R,S對映異構(gòu)體分別置于體系中孵育。孵育完全后，將處理好的樣品注入到 UHPLC-Q-TOF-MS/MS色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行數(shù)據(jù)采集。借助采集到的高分辨一級二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推測代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，闡述其代謝途徑并比較其異同。
　　結(jié)果：通過與空白樣品比較，結(jié)合對照品的裂解規(guī)律，共從溫孵樣品中共鑒定出34個代謝產(chǎn)物，其中R-間尼索地平樣品

9、中鑒定出18種代謝產(chǎn)物，S-間尼索地平樣品中鑒定出16種代謝產(chǎn)物。
　　結(jié)論：通過對代謝產(chǎn)物的歸納總結(jié)，得到了間尼索地平的體外代謝規(guī)律，主要包括氧化反應、去氫反應和酯水解反應等。
　　第三部分基于體外模型的間尼索地平對映體對人肝CYP450酶的影響
　　目的：基于HepG2細胞系及人肝微粒體代謝體系，研究間尼索地平對映體對人肝細胞色素氧化酶 CYP450主要亞型 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、

10、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的誘導或抑制作用。
　　方法：采用HepG2細胞株，加入不同濃度的間尼索地平對映體共溫孵，采用Real-time PCR技術(shù)考察間尼索地平對映體對CYPs的mRNA表達的影響；參考FDA相關(guān)指導原則，采用CYP450酶特異性探針底物的特征代謝反應，建立了基于LC-MS的探針底物代謝物檢測方法，用于間尼索地平對映體的體外抑制研究。
　　結(jié)果：Real-time PCR結(jié)果表明，與陰性對

11、照組相比，在上述3種質(zhì)量濃度下，R,S-間尼索地平對映體均對CYP1A2具有明顯的誘導作用（P＜0.05）。R,S-間尼索地平對映體均對CYP2B6具有明顯的抑制作用（P＜0.05）。在低濃度下，R,S-間尼索地平對映體均對CYP3A4具有明顯的誘導作用（P＜0.05），但在中高濃度下，R-間尼索地平對映體均對CYP3A4具有明顯的誘導作用（P＜0.05），而在中高濃度下，S-間尼索地平對映體對CYP3A4無明顯作用。R,S-間尼索地平

12、對映體均對CYP2D6無明顯作用。
　　探針底物抑制結(jié)果表明， R,S-間尼索地平對映體均對CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4具有中等程度的抑制作用，而對CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19沒有抑制作用。
　　結(jié)論：間尼索地平對映體可能會對CYP450代謝酶產(chǎn)生影響，聯(lián)合用藥時應加以關(guān)注。
　　第四部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS的間尼索地平體內(nèi)代謝輪廓研究
　　目的：分析間尼

13、索地平在大鼠體內(nèi)的代謝物，研究間尼索地平及其代謝物在大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律，從而闡明間尼索地平的體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化途徑。
　　方法：首先應用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法分析間尼索地平原藥及已知代謝產(chǎn)物對照品的質(zhì)譜裂解規(guī)律及色譜保留時間，以此作為間尼索地平大鼠體內(nèi)代謝物分析鑒定的依據(jù)；健康雄性Sprague–Dawley(SD)大鼠，灌胃給予間尼索地平，給藥劑量為10 mg/kg，給藥后采用代謝籠收集尿液和糞便。采用液液萃取方法對樣

14、品進行處理，將處理好的樣品注入到UHPLC-Q-TOF-MS/MS儀，以多種數(shù)據(jù)采集模式進行數(shù)據(jù)采集；通過獲得的代謝物質(zhì)譜信息，采用多種數(shù)據(jù)后處理策略推測及確認代謝物結(jié)構(gòu)，根據(jù)得到的代謝物結(jié)構(gòu)和類型闡明間尼索地平在大鼠體內(nèi)的代謝途徑。
　　結(jié)果：通過與空白樣品比較，結(jié)合對照品的裂解規(guī)律，從樣品中共鑒定出25個代謝產(chǎn)物。
　　結(jié)論：該實驗反映了間尼索地平的體內(nèi)代謝規(guī)律，間尼索地平的主要代謝途徑包括氧化反應、去氫反應、酯水解反應

15、，還原反應和甲基化反應等。
　　第五部分基于 UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)的間尼索地平對大鼠肝臟CYP450酶活性的影響
　　目的：采用cocktail探針底物法，研究間尼索地平對大鼠肝細胞色素氧化酶CYP450亞型CYP1A2、CYP2B、CYP2C11、CYP2D1、CYP3A1活性的影響。
　　方法：建立基于UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)的體內(nèi)探針底物檢測方法；將SD大鼠隨機分成空白組、間尼索地平低、中、高

16、劑量組。采用CMC-Na溶液配制間尼索地平低、中、高劑量溶液，灌胃給藥，1日1次，連續(xù)15天。并建立基于LC-MS的體內(nèi)探針底物檢測方法，通過給予低劑量探針藥物，測定藥代動力學參數(shù)，間接考察間尼索地平對大鼠肝臟細胞色素CYP450酶的影響。
　　結(jié)果：建立的體內(nèi)探針檢測方法快速、準確、靈敏度高、專屬性強；研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的間尼索地平長期給藥后對大鼠CYP1A2、CYP2B、CYP2C11、CYP2D1和CYP3A1代謝酶的活性具有