缺氧后不同時(shí)間小鼠腦組織提取液誘導(dǎo)人MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的:缺氧是臨床上非常常見的病理表現(xiàn)，可以造成多系統(tǒng)、多器官的損傷，而神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)于缺氧最為敏感。缺氧可造神經(jīng)細(xì)胞不可逆損害，引起一系列的臨床癥候群，嚴(yán)重時(shí)腦功能活動(dòng)停止，出現(xiàn)腦死亡。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞壞死后，由于神經(jīng)細(xì)胞的不可再生性，即使缺氧等因素去除后，仍可留有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。國(guó)內(nèi)外主要采用改善腦循環(huán)、促進(jìn)腦代謝、抗凝及脫水等藥物治療，并從降低神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡等方面加強(qiáng)和改進(jìn)了治療措施，對(duì)缺血半暗帶的損傷顯示了一定的治療效果，但不

2、能使己壞死的神經(jīng)細(xì)胞再生，對(duì)于已發(fā)生壞死的腦組織，臨床療效不滿意。因此，有必要尋找一種切實(shí)有效的修復(fù)受損腦組織的治療方法。 干細(xì)胞是具有自我復(fù)制，高度增殖及多向分化潛能的細(xì)胞群體，一方面可以通過(guò)細(xì)胞分裂維持自身細(xì)胞群的大小，同時(shí)又可以進(jìn)一步分化成各種不同的組織細(xì)胞，從而構(gòu)成機(jī)體復(fù)雜的組織器官。目前，國(guó)內(nèi)外一些研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有自我更新、高度增殖以及在特定條件下進(jìn)行多向分化的特性，包括向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的潛

3、能。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，外源性MSCs不僅可在正常小鼠的腦內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元，表達(dá)神經(jīng)特異核蛋白(NeuN)；還可以在腦組織缺血缺氧性損傷的情況下，在體內(nèi)誘導(dǎo)分化為有一定功能的神經(jīng)元細(xì)胞。在腦細(xì)胞壞死急性期存在氧自由基、溶解酶、吞噬細(xì)胞等，不利于MSCs存活。腦缺氧時(shí)，防御和應(yīng)激反應(yīng)可觸發(fā)和啟動(dòng)一系列內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)，此時(shí)移植可能更有利于MSCs存活增殖及向神經(jīng)細(xì)胞分化。但后期膠質(zhì)瘢痕形成會(huì)阻礙神經(jīng)突起發(fā)育，影響神經(jīng)再生與重建。缺氧后不同時(shí)間腦

4、組織提取液對(duì)MSCs有何影響，在腦缺氧性損傷后何時(shí)進(jìn)行移植為最佳時(shí)間，目前國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。 本課題擬研究對(duì)于缺氧造成神經(jīng)損傷的小鼠，在缺氧后不同時(shí)段提取其腦組織勻漿提取液對(duì)MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，能否將MSCs誘導(dǎo)成為神經(jīng)元樣細(xì)胞；及比較不同時(shí)段的誘導(dǎo)液誘導(dǎo)MSCs成神經(jīng)元樣細(xì)胞的陽(yáng)性率，尋找移植最佳時(shí)間。為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及今后臨床移植的開展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)純化體外和培養(yǎng)1、MSCs的分離培

5、養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察無(wú)菌條件下取正常兒童骨髓(自愿供者)2ml，加入含有1.5ml的10％肝素液的離心管中，充分混勻.加入適量PBS液混勻，以1000r/min離心10min，吸凈上液；再用PBS液洗一遍(方法同前)，用含10％FBS的完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將其接種在25CM2培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下每日觀察1次。72小時(shí)半量換液，去除雜質(zhì)細(xì)胞及未貼壁的細(xì)胞。約90％貼壁細(xì)胞接近融合時(shí)，用

6、PBS沖洗2次以除去培養(yǎng)瓶中的含血清培養(yǎng)基，以適量0.25％胰蛋白酶-EDTA室溫消化，將細(xì)胞懸液按1∶2或1∶3比例傳代接種。待傳代細(xì)胞生長(zhǎng)接近完全融合時(shí)，可繼續(xù)傳代。 2、MSCs的鑒定MSCs培養(yǎng)至第5代時(shí)，以適量0.25％胰蛋白酶-EDTA室溫消化，PBS洗2次后吹打成單細(xì)胞懸液送流式細(xì)胞儀室檢測(cè)CD34、CD44、CD29。 二、腦缺氧小鼠動(dòng)物模型的建立及腦勻漿誘導(dǎo)液的制備1、腦缺氧小鼠動(dòng)物模型的建立將6～8周

7、正常成年昆明小鼠(雌性)放入密閉的透明塑料箱中，通含8％O2及92％N2的混合氣體，氣體流量為2L/min，箱體的另一端與外界相通，以保持箱內(nèi)的壓力與大氣一致。箱內(nèi)置鈉石灰以吸收小鼠呼出的CO2，水硅膠以吸收水蒸氣。通氣2.5小時(shí)后，將小鼠放出，恢復(fù)正常通氣于自然空氣中。 2、腦勻漿誘導(dǎo)液的置備將缺氧小鼠隨機(jī)分為5組，每組8只(n=8).分別在缺氧后1天(A1)，4天(A4)，7天(A7)，10天(A10)，13天(A13)引頸

8、處死.在無(wú)菌條件下取出腦組織.一側(cè)腦組織以10％福爾馬林固定，以備制作病理切片用；一側(cè)腦組織稱重，按每150ml濕重加1ml的L-DMEM培養(yǎng)基的比例研磨，將研磨好的腦勻漿以2000r/min，離心10min，吸取上清夜，以0.22um微孔濾膜過(guò)濾除菌后制備成誘導(dǎo)液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時(shí)37℃水浴解凍，按20％比例以L-DMEM培養(yǎng)基稀釋使用。 三、MSCs誘導(dǎo)成為神經(jīng)元樣細(xì)胞及細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定1、MSCs誘導(dǎo)成為神經(jīng)元

9、樣細(xì)胞將P5代MSCs細(xì)胞按104～105/ml濃度接種到12孔板中。接種48小時(shí)后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，將12孔板中的含血清的完全培養(yǎng)基吸凈，用PBS洗2次，分為三組(A、B、C)，分別加入已配制好的誘導(dǎo)液。置37℃、5％CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每1小時(shí)倒置相差顯微鏡下觀察一次，記錄細(xì)胞形態(tài)變化。 A組：加入缺氧小鼠腦勻漿誘導(dǎo)液B組：加入正常小鼠腦勻漿誘導(dǎo)液C組：加入L-DMEM培養(yǎng)基對(duì)照2、MSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)元

10、樣細(xì)胞的免疫化學(xué)鑒定及陽(yáng)性率表達(dá)誘導(dǎo)液作用8小時(shí)之后，用熒光免疫組化的方法檢測(cè)神經(jīng)元樣細(xì)胞所特有的兔抗人神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)、及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞所特有的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，加入熒光二抗CY3(羊抗兔免疫球蛋白)，陽(yáng)性細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈紅色熒光。神經(jīng)元樣細(xì)胞免疫組染色后顯微鏡下隨機(jī)數(shù)取8個(gè)非重疊視野(×100)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 結(jié)果一、MSCs的純化和體外培養(yǎng)1、MSCs原代培養(yǎng)及

11、傳代正常兒童骨髓接種于培養(yǎng)瓶3天后，可見少量細(xì)胞貼壁，7天可見較多貼壁細(xì)胞出現(xiàn)，12～14天細(xì)胞接近90％融合。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較原代培養(yǎng)增快，3～4天可再次傳代，可見細(xì)胞呈漩渦狀排列。 2、MSCs的鑒定經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，第5代細(xì)胞CD34陰性，CD44、CD29陽(yáng)性。表明純化的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 二、腦缺氧動(dòng)物模型的制作將6～8周正常成年昆明小鼠(雌性)放入密閉的透明塑料箱中，通含8％O2及92％N2的混合氣體。

12、在通氣的2.5h過(guò)程中，小鼠相繼出現(xiàn)煩躁、活動(dòng)減少、平衡失調(diào)、抑制嗜睡及全身抖動(dòng)的現(xiàn)象。 制作的病理切片表明：顯微鏡下見正常對(duì)照組大腦組織結(jié)構(gòu)層次清晰細(xì)胞輪廓正常，核居中，核仁清楚。缺氧模型組出現(xiàn)大腦皮質(zhì)、紋狀體、海馬和丘腦見壞死細(xì)胞溶解，神經(jīng)元核固縮，以海馬區(qū)的錐狀細(xì)胞層最為明顯；病灶中心見固縮核和核碎片，病灶周圍有少量膠質(zhì)細(xì)胞增生。隨時(shí)間推移神經(jīng)元壞死、變性趨于穩(wěn)定，病灶周圍增生星形膠質(zhì)細(xì)胞增多，皮層、紋狀體、海馬和丘腦形成

13、少量膠質(zhì)瘢痕。 三、MSCs誘導(dǎo)成為神經(jīng)元樣細(xì)胞及其免疫化學(xué)鑒定1、MSCs誘導(dǎo)成為神經(jīng)元樣細(xì)胞MSCs誘導(dǎo)3小時(shí)后，就可見少量細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)改變，MSCs細(xì)胞向核收縮，胞體變圓，折光性變強(qiáng)；6小時(shí)后，可見一部分細(xì)胞轉(zhuǎn)變成類似神經(jīng)元樣細(xì)胞的形態(tài)，突起伸出。8小時(shí)后，突起數(shù)目由開始的兩極發(fā)展到3～5個(gè)多極，并在軸突末端出現(xiàn)一級(jí)和二級(jí)類似樹突的分支，有些細(xì)胞突起相互連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。對(duì)照組細(xì)胞仍保持原有形態(tài)不變。 2、MSCs

14、誘導(dǎo)成神經(jīng)元樣細(xì)胞的免疫化學(xué)鑒定及陽(yáng)性率表達(dá)腦組織提取液誘導(dǎo)8小時(shí)后，那些折光性強(qiáng)有突起的細(xì)胞表現(xiàn)為NSE染色強(qiáng)陽(yáng)性，熒光顯微鏡下呈紅色。各組NSE的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率為與A1(11.69±2.10％)、A4(13.66±2.31％)、A7(15.09±2.28％)、A10(21.02±3.38％)及A13(14.68±4.44％)，其中A10組的陽(yáng)性率最高，與其他各組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。B組(20.48±3.16％)，除A10組外，其他各組均低于