大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1．探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的分離培養(yǎng)和體外擴(kuò)增方法。 2．研究其在當(dāng)歸注射液或β—巰基乙醇(β—Mercaptoethanol，BME)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下向神經(jīng)元細(xì)胞分化的能力，以提供一種較好的誘導(dǎo)方案。 3．明確堿性成纖維生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)在誘導(dǎo)劑定向誘導(dǎo)過程中所起的作用，以優(yōu)化誘導(dǎo)方案

2、。 4．觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、體外擴(kuò)增及定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞過程中的生物學(xué)特性，為今后臨床研究提供良好的種子細(xì)胞來源。 方法： 無菌條件下取大鼠骨髓，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)篩選法分離出成年大鼠MSCs，進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，觀察其生物學(xué)特性。取生長良好的第5代MSCs經(jīng)堿性成纖維生長因子(bFGF)預(yù)誘導(dǎo)后用當(dāng)歸注射液或β—巰基乙醇(β—Mercaptoethanol，BME)誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元樣

3、細(xì)胞分化，并針對堿性成纖維生長因子(bFGF)在誘導(dǎo)過程所起作用設(shè)立三組實(shí)驗(yàn)對照組，包括對照組1：預(yù)誘導(dǎo)液中不含bFGF和誘導(dǎo)液中不含當(dāng)歸注射液或BME誘導(dǎo)劑；對照組2：預(yù)誘導(dǎo)液中含bFGF，而誘導(dǎo)液中不含當(dāng)歸注射液或BME誘導(dǎo)劑；對照組3：預(yù)誘導(dǎo)液中不含bFGF，而誘導(dǎo)液中含有當(dāng)歸注射液誘導(dǎo)劑。倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)過程中細(xì)胞形態(tài)所發(fā)生的變化，并通過細(xì)胞免疫化學(xué)法鑒定經(jīng)各組誘導(dǎo)后所得細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物神經(jīng)巢蛋白(neuroepith

4、elial stem cell protein，Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron—specific Enolase，NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein，GFAP)的表達(dá)。經(jīng)鏡下計(jì)數(shù)誘導(dǎo)分化后所得細(xì)胞的陽性表達(dá)率，用統(tǒng)計(jì)學(xué)q檢驗(yàn)方法比較各組之間的差異。 結(jié)果： 大鼠MSCs可用貼壁培養(yǎng)篩選法成功分離并在體外大量擴(kuò)增。經(jīng)當(dāng)歸注射液或BME誘導(dǎo)，MSCs可

5、向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，均出現(xiàn)胞體和突起，細(xì)胞免疫化學(xué)染色神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，巢蛋白(Nestin)陽性，神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)呈陰性。且經(jīng)堿性成纖維生長因子(bFGF)預(yù)誘導(dǎo)的當(dāng)歸組較未經(jīng)bFGF預(yù)誘導(dǎo)的對照組3誘導(dǎo)成神經(jīng)元樣細(xì)胞的陽性細(xì)胞表達(dá)率明顯提高。 結(jié)論： 貼壁分離培養(yǎng)法分離的MSCs能在體外培養(yǎng)條件下生長良好、可連續(xù)傳代，體外培養(yǎng)擴(kuò)增能力較強(qiáng)，以當(dāng)歸注射液或β—巰基乙醇作用于MSCs可成功誘