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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:
惡性腫瘤細(xì)胞代謝重編程是其生物學(xué)特點(diǎn)之一,其中脂代謝重編程對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和侵襲轉(zhuǎn)移力的改變具有重要作用。脂肪既是細(xì)胞能量的來(lái)源,也是構(gòu)成細(xì)胞的成分。脂肪代謝過(guò)程涉及到多種酶,這些酶的活性改變不僅會(huì)影響腫瘤脂代謝,也會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。在脂代謝相關(guān)酶中,輔酶CGI-58是甘油三酯水解酶(ATGL)的輔助激活因子,協(xié)助將甘油三酯水解為游離脂肪酸和甘油二酯。CGI-58基因被敲除后不僅會(huì)改變腫瘤細(xì)胞的代謝,在我們
2、的研究中還發(fā)現(xiàn)可以改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性尤其是侵襲力。我們之前的研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞的CGI-58基因表達(dá)和腫瘤的惡性程度及侵襲力有相關(guān)性,但是如果通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA敲除CGI-58后發(fā)現(xiàn),不同細(xì)胞侵襲力的變化是有差別的,其中以結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116和卵巢癌細(xì)胞SKOV3的侵襲力變化差異最為明顯:前者發(fā)生了促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),后者發(fā)生的則是抑制侵襲轉(zhuǎn)移的間質(zhì),上皮轉(zhuǎn)化(MET)。同一基因的敲除在不同的腫瘤細(xì)胞中
3、帶來(lái)完全相反的結(jié)果,為了探尋腫瘤細(xì)胞在CGI-58基因調(diào)控的脂代謝介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT-MET變化的機(jī)制,同時(shí)了解CGI-58基因在臨床卵巢癌標(biāo)本中表達(dá)的情況,以及它和卵巢癌臨床病理之間的關(guān)系,我們?cè)O(shè)計(jì)了本課題并加以驗(yàn)證。
目的:
1.構(gòu)建卵巢癌細(xì)胞的CGI-58基因敲除模型;檢測(cè)CGI-58敲除的SKOV3細(xì)胞發(fā)生的代謝變化;
2.觀察卵巢癌細(xì)胞SKOV3失去CGI-58表達(dá)對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移力的影響,通過(guò)一
4、系列回復(fù)實(shí)驗(yàn),探討影響CGI-58敲除后腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT-MET的關(guān)鍵分子及相關(guān)信號(hào)通路,以及相關(guān)的作用機(jī)制;
3.檢測(cè)CGI-58在卵巢癌臨床標(biāo)本中的表達(dá)水平;分析CGI-58的表達(dá)和臨床病理參數(shù)之間的意義。
方法:
1.材料:卵巢癌細(xì)胞SKOV3,OVCAR3,結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116(分含有野生型p53及不含p53兩種),手術(shù)切除的臨床卵巢癌標(biāo)本;CGI-58 shRNA質(zhì)粒,β-catenin和p
5、53過(guò)表達(dá)質(zhì)粒;慢病毒包裝試劑,細(xì)胞培養(yǎng)試劑,免疫組化/免疫熒光染色試劑、WestemBlot試劑、各種生化試劑等。
2.方法:CGI-58敲除細(xì)胞系、β-catenin過(guò)表達(dá)細(xì)胞系和p53過(guò)表達(dá)細(xì)胞系通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并使用藥物篩選建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系;蛋白表達(dá)水平和分布位置通過(guò)Western Blot和免疫熒光染色檢測(cè);細(xì)胞脂肪滴和線粒體活性使用熒光染色劑染色觀察其熒光強(qiáng)度;甘油三酯和游離甘油含量檢測(cè),細(xì)胞活性氧(R
6、OS)含量檢測(cè)使用光密度比色法;細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖力檢測(cè)使用CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn);細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移力檢測(cè)使用劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn);細(xì)胞自噬通過(guò)去除血清法,脂解功能通過(guò)激素刺激法,其中的蛋白和甘油三酯/游離甘油含量檢測(cè)使用WB和比色法;組織芯片使用免疫組化染色,評(píng)分分值為染色面積和強(qiáng)度兩部分之和組成。
結(jié)果:
1.慢病毒敲除CGI-58基因表達(dá)后,卵巢癌細(xì)胞SKOV3在細(xì)胞漿中出現(xiàn)大量脂肪滴,活細(xì)胞熒光染色可見到
7、脂滴的綠色熒光,細(xì)胞甘油三酯含量測(cè)定顯示敲除細(xì)胞內(nèi)甘油三酯水平明顯高于非敲除細(xì)胞。脂解實(shí)驗(yàn)結(jié)果:SKOV3細(xì)胞內(nèi)脂肪水解酶HSL不受CGI-58基因表達(dá)減少影響,可在外源性激素的作用下水解部分甘油三酯,但是SKOV3細(xì)胞甘油三酯合成能力強(qiáng),在脂解作用發(fā)生時(shí)可以迅速?gòu)姆侵愇镔|(zhì)合成代償甘油三酯的損失。
2.WB檢測(cè)糖\脂代謝的相關(guān)酶類發(fā)現(xiàn):和對(duì)照組細(xì)胞相比,CGI-58敲除細(xì)胞中負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)ATP: AMP比例的酶AMPKα,磷酸化
8、水平上升,脂肪酸合成相關(guān)酶ACC和氧化磷酸化相關(guān)酶AKT的磷酸化水平無(wú)變化,抑制糖原合成的GSK-3β酶磷酸化水平降低;活細(xì)胞線粒體染色顯示CGI-58敲除細(xì)胞的線粒體呼吸和氧化功能弱于非敲除細(xì)胞,在ROS實(shí)驗(yàn)中敲除細(xì)胞的OD-時(shí)間曲線斜率高于非敲除細(xì)胞,提示細(xì)胞內(nèi)有ROS物質(zhì)堆積。
3.CGI-58敲除后,CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果中敲除細(xì)胞生長(zhǎng)曲線斜率和非敲除細(xì)胞相比,呈下降的局勢(shì),在細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)中,敲除細(xì)胞在相同數(shù)量相同時(shí)間相
9、同條件下培養(yǎng),最后形成的克隆斑面積明顯少于非敲除細(xì)胞。
4.觀察細(xì)胞的形態(tài),WB檢測(cè)CGI-58敲除的SKOV3細(xì)胞上皮和間質(zhì)性的標(biāo)記物,發(fā)現(xiàn)在CGI-58敲除細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cad水平上調(diào),間質(zhì)標(biāo)記物N-cad、vimentin和slug水平下調(diào),細(xì)胞形態(tài)由間質(zhì)型向上皮型轉(zhuǎn)化。同時(shí)劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也提示敲除細(xì)胞在侵襲、轉(zhuǎn)移等諸多方面的能力都要低于非敲除細(xì)胞。
5.自噬相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:敲除CG
10、I-58的細(xì)胞的自噬標(biāo)記物L(fēng)C3的表達(dá)水平高于非敲除細(xì)胞,說(shuō)明CGI-58敲除后細(xì)胞自噬水平上升;當(dāng)使用LC3抑制劑3-MA抑制自噬后,LC3表達(dá)水平下降后,敲除和非敲除細(xì)胞之間E-cad的水平差異無(wú)變化。
6.在卵巢癌細(xì)胞中,有p53表達(dá)的OVCAR3和無(wú)p53表達(dá)的SKOV3細(xì)胞在CGI-58敲除后,E-cad的改變是不同的;而當(dāng)分別改變SKOV3細(xì)胞和HCT-116細(xì)胞中p53的狀態(tài),將HCT-116細(xì)胞的p53沉默,在
11、失去p53表達(dá)后,再敲除CGI-58不會(huì)引起E-cad表達(dá)水平降低;而將p53過(guò)表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入敲除CGI-58的SKOV3細(xì)胞中,E-cad表達(dá)則會(huì)下降。
7.CGI-58敲除后,SKOV3細(xì)胞β-catenin和Wnt-5a/b信號(hào)水平下降,把β-catenin過(guò)表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)慢病毒整合到CGI-58敲除細(xì)胞的染色體上,WB檢測(cè)顯示,在β-catenin過(guò)表達(dá)質(zhì)粒整合入染色體并發(fā)揮作用后,其上皮標(biāo)志物E-cad下降而N-cad上
12、升。細(xì)胞形態(tài)上又從上皮型向間質(zhì)型回復(fù)。
8.組織芯片免疫組化染色評(píng)分結(jié)果顯示:卵巢癌組織中CGI-58表達(dá)呈陽(yáng)性(強(qiáng)陽(yáng)性)的占標(biāo)本總數(shù)的85.4%,其表達(dá)水平和患者年齡、淋巴結(jié)侵犯、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及臨床分期等病理參數(shù)無(wú)關(guān),只和腫瘤的浸潤(rùn)深度及范圍具有相關(guān)性。
結(jié)論:
1.CGI-58在卵巢癌細(xì)胞SKOV3甘油三酯分解中具有重要作用:CGI-58缺失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)甘油三酯異常積聚,ATP生成減少,同時(shí)還削弱細(xì)胞線粒體的
13、呼吸氧化功能,引起細(xì)胞內(nèi)的脂代謝重編程,改變了SKOV3細(xì)胞的代謝模式。
2.CGI-58敲除后引起的代謝重編程導(dǎo)致SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)增殖受到抑制,自噬水平提升,最主要的變化是細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移力下降,使得在其形態(tài)上發(fā)生MET變化。
3.CGI-58敲除后導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT/MET改變,依賴于腫瘤細(xì)胞p53的狀態(tài),p53的狀態(tài)改變可以決定細(xì)胞失去CGI-58后發(fā)生EMT還是MET。
4.CGI-58表達(dá)水平
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