兔虹膜色素上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞VEGF及其受體FLK-1 mRNA表達(dá)的對(duì)比研究.pdf

1、目的:虹膜色素上皮(IPE)細(xì)胞與視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞具有相同的胚胎發(fā)育來(lái)源,基本具備RPE細(xì)胞的生理功能,且取材方便,可望替代RPE細(xì)胞實(shí)現(xiàn)自體移植,治療老年性黃斑變性(ARMD)、視網(wǎng)膜色素變性、黃斑營(yíng)養(yǎng)不良等疾病.我們采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)兔眼IPE細(xì)胞和RPE細(xì)胞VEGF及其受體之一FLK-1 mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)和對(duì)比,為IPE細(xì)胞代替RPE細(xì)胞移植提供理論依據(jù).方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康成年有色家兔.I

2、PE細(xì)胞和RPE細(xì)胞的分離:摘取家兔眼球,無(wú)菌操作下沿角膜緣后2mm環(huán)形剪開(kāi)眼球壁,用0.25﹪胰蛋白酶-0.02﹪EDTA溶液將IPE細(xì)胞和RPE細(xì)胞分別消化分離下來(lái),收集到eppendorf管內(nèi),立即放入干冰中并于-80℃保存?zhèn)溆?IPE細(xì)胞和RPE細(xì)胞總RNA的提取:用TRIzol試劑分別提取兩種細(xì)胞的總RNA.PCR引物:目的基因?yàn)橥肰EGF(AC:AB020216)、FLK-1(AC:AB017155),內(nèi)參基因?yàn)橥忙?act

3、in(AC:AF309819).RT-PCR:RT:應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶AMV將IPE細(xì)胞和RPE細(xì)胞RNA分別逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA.PCR:以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,以β-actin為內(nèi)參,用PCR擴(kuò)增各目的基因.PCR產(chǎn)物電泳及定量分析:取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠圖像分析軟件分析并計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)含量.以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)四次,所得結(jié)果作兩樣本均數(shù)差異的t檢驗(yàn).結(jié)果;RNA樣品鑒定:該實(shí)驗(yàn)所提取的總RNA完整,無(wú)明顯降解.RT-PCR產(chǎn)