重組hGM-CSF乳酸鏈球菌對(duì)TNBS誘導(dǎo)的大鼠腸損傷的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景 腸道損傷與腸粘膜屏障功能改變密切相關(guān)，特別是腸粘膜生物屏障及免疫屏障日漸受到重視。炎癥性腸病(Inflammatory Bowl Desease,IBD)包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)的發(fā)病與遺傳背景、免疫調(diào)節(jié)失控和個(gè)體差異以及環(huán)境因素等多方面原因有關(guān)，但最終表現(xiàn)為腸粘膜對(duì)腸道微生物抗原免疫反應(yīng)失常而導(dǎo)致腸粘膜損傷和破壞。資料顯示，IBD

2、發(fā)病率逐年增高，已成為嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的常見(jiàn)疾病。IBD的傳統(tǒng)治療主要是針對(duì)腸道微生物感染和免疫系統(tǒng)的激活，以非特異性抗炎藥物和免疫抑制劑為主，并輔以抗菌藥物。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，上述療法存在明顯的藥物毒性反應(yīng)和全身性副作用，特別是針對(duì)頑固性CD的治療仍缺乏有效的措施，不能改變CD的自然病程。近年來(lái)的研究表明，CD的生物是調(diào)整各種炎癥因子水平的有效方法，但確切療效及生物安生性尚待關(guān)注。 新近研究顯示，CD發(fā)生的機(jī)制可能與腸道先天免

3、疫反應(yīng)缺陷以及中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞功能受損有關(guān)；重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)、重組人粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)可通過(guò)增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的趨化性、單核巨噬細(xì)胞的功能而調(diào)節(jié)腸道自然免疫狀態(tài)，從而對(duì)CD的治療發(fā)揮作用。目前臨床應(yīng)用或研究的重組hGM-CSF主要是把編碼hGM-CSF的cDNA與相應(yīng)表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化于大腸桿菌、酵母菌、減毒沙門(mén)氏菌及腺病毒等得來(lái)，用藥途徑為經(jīng)皮下注射，存在一些全身毒副作用

4、。 腸道粘膜免疫及系統(tǒng)免疫可由不同組群的腸道共生菌(Commensal bacteria)調(diào)節(jié)。乳酸鏈鏈菌(Streptococcus lactis；Lactococcus lactis)為腸道共生菌，屬于相對(duì)安全菌株(generally regard as safe，GRAS)，它可改善胃腸微生態(tài)平衡，抑制腸道致病菌粘附及腸粘膜對(duì)細(xì)菌易位的易感性而加強(qiáng)腸粘膜屏障功能。由于該菌具有不產(chǎn)生內(nèi)毒素而且產(chǎn)生的蛋白酶遠(yuǎn)少于大腸桿菌等優(yōu)點(diǎn)

5、，同時(shí)經(jīng)改造后的乳鏈菌耐酸、耐膽汁，因而被大量用于表達(dá)多種生物多肽或蛋白。近來(lái)，SteidlerLetal，Vandenbrotlcke K etal相繼成功構(gòu)建了能經(jīng)口服投遞到腸道分泌表達(dá)有活性的hIL-10、hTFF蛋白的重組乳鏈菌并用于實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的治療，取得了一定的療效。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)重組hGM-CSF乳酸鏈球菌的報(bào)道。目的及意義構(gòu)建能在腸道直接分泌表達(dá)hGM-CSF活性的重組乳酸鏈球菌，經(jīng)口服用于克羅恩病動(dòng)物模型的治療，以期為

6、克羅恩病的治療提供更理想的途徑。重組hGM-CSF乳酸鏈球菌可以同時(shí)發(fā)揮hGM-CSF和乳酸鏈球菌的腸粘膜保護(hù)作用，并具有可在局部表達(dá)活性、無(wú)抗原性、使用安全、服用方便、便于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，可能發(fā)揮更佳的治療作用。主要內(nèi)容及方法、結(jié)果本課題中，參照GenBank公布的序列，設(shè)計(jì)及構(gòu)建乳鏈菌分泌型表達(dá)系統(tǒng)；采用了基因拼裝(PCR based gene assembly，PBGA)及基因克隆(gene cloning)技術(shù)優(yōu)化了hGM-C

7、SF的基因編碼，并體外合成了hGM-CSF cDNA；構(gòu)建了hGM-CSF乳酸鏈球菌表達(dá)載體pTRCSF；獲得表達(dá)。hGM-CSF的重組乳鏈菌LL-CSF；為驗(yàn)證hGM-CSF的重組乳鏈菌能否在腸道定植并分泌表達(dá)，同時(shí)又構(gòu)建了其帶綠色熒光的表達(dá)載體pTRCSFGFP及重組菌LL-CSFGFP；通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)了重組hGM-CSF。乳酸鏈球菌中hGM-CSF的蛋白表達(dá)及其活性；最后經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)價(jià)其對(duì)TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸損傷(發(fā)病機(jī)制

8、及病理改變類似人類CD)，的保護(hù)作用。 結(jié)論 1成功拼接了hGM-CSFcDNA及乳酸鏈球菌分泌型表達(dá)系統(tǒng)基因PUS。 2成功構(gòu)建了乳酸鏈球菌分泌型表達(dá)系統(tǒng)pPUS。 3成功構(gòu)建了重組hGM-CSF乳酸鏈球菌的克隆載體pPUSCSF、pPUSCSFGFP，表達(dá)載體pTRCSF及其驗(yàn)證載體pTRCSFGFP。 4成功構(gòu)建了重組hGM-CSF乳酸鏈球菌LL-CSF。 5重組hGM-CSF乳酸鏈