重組hGM-CSF在煙草中表達(dá)的研究.pdf

1、人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)是一種具有多項(xiàng)潛能的造血生長因子，具有十分重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，在國際生物技術(shù)制藥市場上占有重要的位置。本研究根據(jù)已知的hGM-CSF序列設(shè)計(jì)引物，以質(zhì)粒pBR322-hGM-CSF為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到hGM-CSF基因，將其分別克隆到大腸桿菌表達(dá)載體和植物表達(dá)載體中，為了增強(qiáng)外源的表達(dá)，采用不同的啟動(dòng)子及調(diào)控序列構(gòu)建了不同的植物表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化原核宿主DH5α和真核宿主煙草中, 建立

2、hGM-CSF-GUS融合基因的表達(dá)系統(tǒng)，并對各表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行外源基因表達(dá)效率的比較，以期為建立高效的生產(chǎn)藥用蛋白hGM-CSF的生物反應(yīng)器系統(tǒng)探索新的途徑。 本研究獲得主要結(jié)果如下： 采用PCR的方法克隆了hGM-CSF基因，插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，獲得重組質(zhì)粒pGEX-hGM-CSF，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE鑒定并用Western blot檢測。SDS-P

3、AGE顯示結(jié)果，得到40.5KD的目的蛋白，表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的17.9％。Western blot檢測表明，抗hGM-CSF單抗可與相對分子量40.5KD大小的電泳條帶發(fā)生特異性反應(yīng)，表明目的蛋白hGM-CSF可有效表達(dá)； 克隆了煙草泛素啟動(dòng)子Ubi.U4，并與 CaMV35S啟動(dòng)子、Ω序列以及Kozak序列組合構(gòu)建了八個(gè)hGM-CSF-GUS基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草。研究結(jié)果表明，煙草泛素啟動(dòng)子Ubi.U4與CaMV35S串

4、聯(lián)使用，并附加Kozak序列，顯著提高了GUS基因的表達(dá)效果，其瞬時(shí)表達(dá)效率和在轉(zhuǎn)基因植株中穩(wěn)定表達(dá)效率分別為99.93+3.06 nmol 4-MU mg-1 protein min-1和116.66+16.83 nmol 4-MU mg-1 protein min-1，是單獨(dú)使用CaMV35S啟動(dòng)子的10倍（10.12+0.92 nmol 4-MU mg-1 protein min-1）和4倍（28.69+4.64 nmol 4-M

5、U mg-1 protein min-1）左右，可見來源于雙子葉植物煙草的泛素啟動(dòng)子Ubi.U4對CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的外源基因的表達(dá)有增作用。 煙草泛素啟動(dòng)子附加Kozak序列的瞬時(shí)表達(dá)活性和穩(wěn)定表達(dá)活性大約為CaMV35S啟動(dòng)子的2.5倍和2倍，說明來源于煙草的泛素啟動(dòng)子與Kozak序列在煙草中也具有一定的協(xié)同增效表達(dá)的作用。 八種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化hGM-CSF-GUS基因共得到438株再生煙草植株，其中GUS檢測陽