DN大鼠腎內(nèi)小動脈早期骨基質(zhì)蛋白的表達及非洛地平對其作用的實驗研究.pdf

1、目的:糖尿病(diabetes mellitus，DM，)的血管病變是DM的主要并發(fā)癥，其大血管病變性質(zhì)為動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)，主要累及主動脈、冠狀動脈等大血管。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是DM的重要并發(fā)癥，其發(fā)生、發(fā)展與糖尿病微血管損害有關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)血管鈣化是進展性．AS的普遍特征，是糖尿病患者發(fā)生心血管事件的重要預(yù)測因素。已有的研究表明DM患者較非DM患者更易發(fā)生血

2、管鈣化，而糖尿病伴發(fā)腎病者血管鈣化更為普遍和嚴重。由于目前對DM血管鈣化的實驗研究多集中于冠狀動脈、腎動脈等大動脈，對臟器內(nèi)(如腎臟內(nèi))的小血管改變知之甚少。因此我們建立了鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病動物模型，擬采用免疫組化、原位雜交及實時熒光定量PCR(real time polymerase chain reaction，Real-TimePCR)等方法，多時點動態(tài)觀察糖尿病腎病腎內(nèi)小動脈上與血管鈣化密

3、切相關(guān)的骨基質(zhì)蛋白如核結(jié)合因子α亞單位1(core-binding factor a<,1>，Cbfa1)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、骨鈣素(osteocalcin，OC)等的表達變化。旨在研究這些骨基質(zhì)蛋白在腎臟中的變化規(guī)律，了解腎內(nèi)小動脈有無血管鈣化的發(fā)生，以及它們的改變是否參與了糖尿病腎臟的發(fā)生發(fā)展。同時觀察長效非洛地平這一鈣離子拮抗劑是否對DM的血管鈣化有改善作用。 方法:雄性成年SD大鼠，標(biāo)準(zhǔn)

4、化喂養(yǎng)。、設(shè)對照組、糖尿病組和非洛地平三組，每組4、8、12、16、24周5個觀察點，每時點6-7只鼠。 糖尿病組和非洛地平組采用STZ腹腔注射造模。造模成功后，干預(yù)組予長效非洛地平10mg/kg體重灌胃，每日一次。處死前留血、尿備測常規(guī)生化指標(biāo)。腎臟石臘切片普通病理及茜素紅染色觀察腎內(nèi)小動脈鈣鹽沉積情況。免疫組化半定量分析Cbfa1，OC，OPG蛋白水平的表達，mRNA原位雜交檢測Cbfa1，OC，OPG mRNA在腎內(nèi)的定位

5、和表達變化。采用Real-Time PCR檢測腎臟OC及OPG mRNA表達并分析各指標(biāo)間相關(guān)性。 結(jié)果:(1)免疫組化顯示。DN組各時點腎小球、腎小管均有Cbfa1的弱陽性表達，自第8周起，腎內(nèi)小動脈中膜上Cbfa1表達逐漸增多，以第24周時表達最明顯。原位雜交結(jié)果提示Cbfa1mRNA表達部位與Cbfa1蛋白表達部位一致，表達量自第8周開始升高，以后隨病程進展表達逐漸上調(diào)，在24周時表達達峰值。而腎小球及腎小管、腎間質(zhì)內(nèi)表達

6、較弱，且隨時間進展變化不大。正常組有Cbfa1蛋白和mRNA的弱陽性表達，各時間點間無差異。(2)免疫組化示DN組第4-12周時腎臟未見OC的明確表達。第16周-24周時，可見在腎內(nèi)小動脈上有OC的弱陽性表達。原位雜交示DN組第4～8周時腎內(nèi)小動脈上無OCmRNA表達，第12周時出現(xiàn)OC mRNA的弱表達，第16-24周時表達進一步增強，表達部位與蛋白表達一致，腎小球及腎小管上無表達。Real-Time PCR結(jié)果提示DN組大鼠腎組織第

7、4～12周無OC mRNA的表達，第16周開始出現(xiàn)OC mRNA的表達，第24周時亦有表達，兩時間點無顯著差異。正常組腎組織未檢測到OC蛋白及mRNA表達。(3)OPG免疫組化提示DN組第4周時腎內(nèi)小動脈上有OPG的弱陽性表達，自第8周時表達增多，12周時達峰值，第16周時表達開始下降，24周時更低。OPG原位雜交結(jié)果顯示OPG蛋白與mRNA表達部位一致，DN組第4周時腎內(nèi)小血管上OPG mRNA表達較弱，第8周起表達逐漸增強，12周時

8、表達達峰值，第16周時表達開始下調(diào)，24周時進一步降低。Real-Time PCR結(jié)果示DN組不同時點OPG mRNA表達存在差異，第8周OPG mRNA表達開始上調(diào)，以12周表達最強，16周后表達逐漸下調(diào)，24周時更低。正常組腎組織有OPG蛋白和mRNA的弱表達，各時點無顯著性差異。(4)Cbfa1，OPG, OC的表達變化與血磷、血脂、腎功及尿蛋白呈正相關(guān)，三者間Cbfa1與OPG和OC相關(guān)性較好， OPG與OC呈正相關(guān)。(5)給予

9、非洛地平干預(yù)后，對血糖、血脂、血鈣磷及尿蛋白無明顯改善，對腎組織病理改變、鈣鹽沉積及Cbfa1，OC的表達無明顯改善。僅OPG的免疫組化和mRNA原位雜交、Real-Time PCR提示在16-24周時，非洛地平干預(yù)組OPG表達高于DN組。(6)腎組織茜素紅染色結(jié)果示正常組各時間點腎組織及腎內(nèi)小動脈無鈣化，糖尿病組及非洛地平組在第16-24周時腎內(nèi)小動脈存在輕一中度鈣化。 結(jié)論:(1) 糖尿病腎病腎內(nèi)小動脈發(fā)生鈣鹽沉積前即已有C

10、bfa1，OC及OPG等骨基質(zhì)蛋白的表達。(2)Cbfa1在糖尿病腎病腎內(nèi)小動脈上表達持續(xù)上調(diào)，其后出現(xiàn)其下游蛋白OC的表達，并最終出現(xiàn)鈣鹽沉積，提示Cbfa1是糖尿病血管鈣化的重要轉(zhuǎn)錄因子，也是血管鈣化的早期生物學(xué)標(biāo)志。(3)OPG在糖尿病腎臟早期表達上調(diào)，后期表達下調(diào)。早期表達上調(diào)可能為機體代償性的保護機制所致，后期下調(diào)與促鈣化因素如高血磷、高血脂的增強有關(guān)。(4)Cbfa1，OC及OPG的表達改變與尿蛋白增高、腎功能下降及血磷升高