2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究目的:
  黃韌帶骨化病會導致嚴重的脊髓神經(jīng)損傷,因其缺乏有效的藥物及其它保守治療手段,手術(shù)是唯一的有效治療方法,但手術(shù)后脊髓神經(jīng)恢復程度有限。前期研究發(fā)現(xiàn)黃韌帶骨化組織中骨橋蛋白及其受體的表達,能誘導體外黃韌帶骨化細胞的骨化指標表達增加,并能誘導黃韌帶骨化動物模型,說明骨橋蛋白在黃韌帶骨化中起著重要作用。但骨橋蛋白在黃韌帶骨化過程中的具體作用機制尚不清楚,本研究旨在從分子通路方面進一步闡明骨橋蛋白在黃韌帶骨化發(fā)生過程中的作用

2、機制。
  研究方法:
  通過組織學以及分子生物學的相關(guān)研究手段明確骨橋蛋白在誘導黃韌帶骨化發(fā)病過程中的作用機制,并通過動物模型進行驗證,從而明確OPN在誘導人黃韌帶細胞骨向分化中的作用。
  2.1 人OLF骨化組織和未骨化的黃韌帶中的OPN和OPN受體的表達。
  分組:將黃韌帶骨化標本分成兩個組,分別為黃韌帶骨化組以及非黃韌帶骨化組,兩組各8例。
  免疫組織化學:將手術(shù)中取的黃韌帶骨化標本經(jīng)過多聚

3、甲醛固定,并組織脫鈣,石蠟包埋后切片后進行OPN、CD44以及Integrin的免疫組織化學染色,封片觀察染色結(jié)果。
  2.2 黃韌帶細胞分離、培養(yǎng)及OPN的骨化誘導。
  分離與培養(yǎng):利用組織塊貼壁法分離人的黃韌帶細胞,分離后的組織塊繼續(xù)貼壁使用,分離出來的細胞倒置顯微鏡觀察其生長形態(tài),長到匯合后傳代,多的細胞液氮凍存?zhèn)溆谩?br>  誘導:將體外培養(yǎng)的第三代黃韌帶細胞種到六孔板中,培養(yǎng)24h后用濃度為100ng/ml的

4、OPN進行干預(yù)48h,WB檢測骨化指標ALP以及OCN在干預(yù)前后的表達變化。
  2.3 骨橋蛋白誘導黃韌帶骨化的分子通路的檢測與確定
  MAPK信號通路磷酸化檢測:將體外培養(yǎng)的第三代黃韌帶細胞種于六孔板中,用濃度為100ng/ml的OPN進行干預(yù),分別在0min、15min、30min、60min、120min時間點終止干預(yù),WB檢測MAPK信號通路分子ERK1/2、P38、JNK在時間梯度上的磷酸化情況。
  信

5、號通路阻滯:分別用ERK1/2、P38特異的抑制劑U0126、SB203580抑制ERK1/2和P38信號分子的磷酸化24h后,WB檢測在OPN誘導黃韌帶細胞48h后的骨化指標ALP以及OCN的表達變化。
  2.4 SB203580抑制P38信號分子對OPN誘導OLF動物模型的影響
  動物模型的處理:在4℃下分別將OPN組:OPN-matrigel、P38阻滯組:OPN-SB203580-matrigel和ERK阻滯組:

6、OPN-U0126-matrigel,經(jīng)椎板間隙注入到黃韌帶。術(shù)后12周Micro-CT檢查各組黃韌帶骨化情況。
  研究結(jié)果:
  3.1 OLF黃韌帶和骨化組織中的OPN和OPN受體的表達
  在所有8例黃韌帶骨化組織中的軟骨細胞周圍可見OPN和CD44表達陽性,而Integrin表達陰性;而OPN、CD44和Integrin在未骨化的黃韌帶細胞周圍表達均陽性,而且在黃韌帶內(nèi)血管內(nèi)皮細胞周圍也均成陽性表達。

7、  3.2 黃韌帶細胞分離、培養(yǎng)及誘導
  組織塊貼壁分離出的黃韌帶細胞大小形狀不一,細胞基質(zhì)透亮,細胞形態(tài)以梭形以及紡錘形為主,同時也有部分細胞形態(tài)呈五角形和橢圓形。原代黃韌帶細胞自胸椎黃韌帶組織塊爬出的早期呈散在性分布,隨后進展逐漸生長密集,并以黃韌帶組織塊為中心,細胞向外周呈輻射狀生長,在和其他黃韌帶組織塊中的原代細胞交會時,則會發(fā)展為渦旋狀生長。黃韌帶骨化組細胞中呈五角形和橢圓形的細胞比非黃韌帶骨化組多,并在顯微鏡視野中可

8、見多個散在細胞結(jié)節(jié)分布。WB檢測骨化組的黃韌帶細胞較正常組細胞OPN表達水平增加。OPN干預(yù)OLF-LFC,WB檢測可見骨化指標ALP、OCN的表達增加。
  3.3 骨橋蛋白誘導黃韌帶骨化的分子通路的檢測與確立
  在0min、15min、30min、60min、120min不同時間點,隨著OPN干預(yù)時間的增加通過WB檢測的ERK1/2以及P38信號分子的磷酸化水平也逐漸增加,但JNK的磷酸化水平隨時間的延長變化不明顯。在

9、P38的抑制劑SB203580的作用下,OPN誘導的骨化組黃韌帶細胞的骨化指標ALP以及OCN的表達水平較未阻滯組顯著下調(diào),且跟空白組的表達水平接近。但在ERK1/2的抑制劑U0126作用下則對OPN誘導的骨化作用抑制不明顯。
  3.4 SB203580阻斷P38通路對OPN誘導OLF動物模型的影響
  術(shù)后12周Micro-CT檢查見OPN組和ERK阻滯組均可見黃韌帶區(qū)可見高密度影,而P38阻滯組未見黃韌帶區(qū)高密度表現(xiàn)。

10、
  研究結(jié)論:
  4.1 黃韌帶骨化區(qū)域中表達OPN及其受體CD44,但未發(fā)現(xiàn)其受體integrin的表達,而在未骨化區(qū)中特別是在血管內(nèi)皮細胞周圍表達OPN、CD44以及integrin。
  4.2 通過體外組織塊貼壁法能有效的培養(yǎng)出黃韌帶細胞,OPN能誘導體外培養(yǎng)的骨化組黃韌帶細胞表達ALP等成骨指標表達增加。
  4.3 OPN能激活MAPK信號通路中的ERK1/2以及P38信號分子的磷酸化,而JNK信

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