毛竹SSR位點引物開發(fā)及部分竹種系統(tǒng)學(xué)分析.pdf

1、竹類植物是禾本科一個最大的自然類群，具有70余屬，1200余種。竹子不僅具有生長快，用途廣等特性，而且還具有良好的水源涵養(yǎng)和水土保持等環(huán)境功能。竹類植物通常難以開花，而且一旦開花，植株乃至全林即全部枯死，因而傳統(tǒng)的以花、果實形態(tài)為主的分類方法對竹類植物十分困難。目前竹子的分類依然存在著很多爭議，而分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用為竹子系統(tǒng)分類的深入開展提供了新的依據(jù)。SSR(Simple Sequence Repeat)簡單序列重復(fù)，又稱為微衛(wèi)星，這

2、類分子標(biāo)記具有含量豐富，多態(tài)程度高，檢測方法簡便，不受環(huán)境和基因表達影響等特點，在種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析以及系譜分析中成為一種理想的分子標(biāo)記。目前，竹類植物的微衛(wèi)星引物開發(fā)國內(nèi)外報道較少，無法滿足竹子系統(tǒng)研究的需要。
　　本研究通過磁珠富集法開發(fā)了31對毛竹SSR引物并對部分竹類植物進行了系統(tǒng)分類學(xué)研究。主要結(jié)果如下：
　　1通過磁珠富集，成功構(gòu)建了毛竹基因組DNA的GT、AG、CCA重復(fù)序列的富集文庫，利用克隆PCR方法

3、共檢測了2330個克隆，三個文庫分別檢測菌落數(shù)為1080、620、630個，陽性克隆分別為219、113、119個，陽性率為19.4％(451/2330)；
　　2獲得350條非冗余序列，長度范圍在61~831bp之間，平均為288bp，序列總長為100704bp，占毛竹基因組大小約1/20000；發(fā)現(xiàn)重復(fù)位點641個，重復(fù)次數(shù)在3～54次之間，其中重復(fù)3、4、5、6、7、8、9、10、>10次的位點數(shù)分別為415、86、37、1

4、4、19、8、12、11、39個；雙核苷酸重復(fù)位點最多，為521個，三核苷酸、四核苷酸位點數(shù)分別為108、35個；
　　3對獲得序列進行 Blast比對，結(jié)果顯示：所得序列與 GenBank登錄序列的毛竹基因序列相似數(shù)最多，為63條，與水稻、甜高粱、小麥、玉米序列相似數(shù)分別為28、11、3、3條，這與毛竹的基因組進化地位相吻合；
　　4設(shè)計合成了53對SSR引物，以毛竹基因組DNA為模板對這些引物是否工作進行了檢測，其中34

5、對引物擴增出了預(yù)期大小的條帶，利用溫度梯度PCR確定了各引物最適退火溫度；
　　5用熒光標(biāo)記物FAM對34對引物中的正向引物進行標(biāo)記，利用毛細(xì)管電泳分析9份毛竹種內(nèi)樣品SSR-PCR擴增產(chǎn)物的大小，其中引物對27、36、40的擴增產(chǎn)物中具有非預(yù)期大小的片段，對這三對引物擴增黃槽毛竹的PCR產(chǎn)物進行了克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)這些位點存在序列重復(fù)；利用其余31個位點對9份毛竹種內(nèi)樣品進行位點特征分析，發(fā)現(xiàn)31個位點在除黃槽毛竹的8個毛竹樣

6、品中都有預(yù)期大小的等位基因的擴增，而黃槽毛竹的位點特征與其他8個毛竹樣品具有較大差異，其中位點2、17、38、42、50對黃槽毛竹顯示零等位，位點8、13、15、18、21、24、28、31、32、33、37、41、43、46、49、51具有不同于其他8個毛竹樣品的特殊等位基因，這些差異位點占總位點數(shù)的61.8%(5+16/34)；
　　6對除黃槽毛竹的8份毛竹樣品的31個SSR位點進行分析，結(jié)果顯示：有18個位點在所有8份毛竹樣

7、品中都只擴增出了一個大小相同的片段，其余13個位點的擴增條帶具有差異，表現(xiàn)出了多態(tài)性；這31個位點的等位基因數(shù)(ObservedNumber ofAlleles,Na)在1~3個之間，平均為1.548個；有效等位基因數(shù)(EffectiveNumber ofAlleles,Ne)在1~2.65之間，平均有效等位基因數(shù)為1.375個；這些位點的觀測雜合度(Observed Heterozygosities, Ho)在0~1之間，平均為0.3

8、09；期望雜合度(Expeeted Heterozygosities，He)在0~0.67之間，平均為0.201；多態(tài)信息含量在0~0.575之間，平均為0.147；13個多態(tài)位點中只有1個位點的多態(tài)信息含量在0.5以上，其余12個位點在0.110~0.48之間，平均為0.352，多態(tài)信息含量較低，這些都表明毛竹種內(nèi)遺傳差異較小，基因突變程度較低；
　　7對唐竹屬、業(yè)平竹屬、大節(jié)竹屬的11個竹種的31個 SSR位點進行了分析，檢測

9、結(jié)果用 NTsys軟件計算竹種間的Nei氏遺傳距離(Nei's Distance)，非加權(quán)算數(shù)平均法(UnweightedPair-groupMethod withArithmeticMeans)對遺傳距離矩陣進行聚類分析，結(jié)果顯示31個SSR位點可以將這11個竹種分為三個屬區(qū)；
　　8對剛竹屬內(nèi)51份樣品的31個SSR位點進行了分析，聚類結(jié)果表明：符合傳統(tǒng)分類學(xué)方法，說明這些SSR位點可以為剛竹屬植物屬內(nèi)的分類提供參考；各竹種種