非編碼RNA在大鼠嚴重燙傷后早期脛骨前肌消耗中的表達譜變化及其生物信息學分析.pdf

1、研究背景:
　　進入二十一世紀以來,人類對于編碼RNA的研究已經(jīng)較為深入,但對于完全解決疾病來講還遠遠不夠。隨著非編碼RNA進入人們的視野,這類以往被認為無任何作用的“暗物質(zhì)”給大家?guī)砹恕绑@喜”。它們通過直接或間接調(diào)控編碼RNA,影響基因、蛋白質(zhì)的功能,從而發(fā)揮重要的生物學功能。近年來,隨著生物信息學技術(shù)的發(fā)展,利用高通量生物芯片技術(shù)研究疾病的病因、診斷、治療,已經(jīng)成為一種新型的研究方法,在臨床與基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用越來越廣泛。我科

2、以往研究發(fā)現(xiàn):嚴重燒傷后高代謝表現(xiàn)為骨骼肌消耗,而且脛骨前肌消耗較為顯著,且發(fā)現(xiàn)燙傷后大鼠在第3天開始即出現(xiàn)脛骨前肌消耗,7天最為明顯,在蛋白水平、基因水平和信號通路方面進一步研究發(fā)現(xiàn):泛素-蛋白酶體介導的蛋白降解、骨骼肌細胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等是燒傷后骨骼肌消耗的重要原因。但略顯不足的是,在非編碼RNA的表觀遺傳學調(diào)控方面的機制尚未進行研究。
　　目的:
　　本研究擬通過高通量芯片篩選嚴重燙傷大鼠早期脛骨前肌非編碼RNA表達

3、譜的改變,應(yīng)用生物信息學分析方法,深入挖掘芯片數(shù)據(jù)提供的信息,發(fā)現(xiàn)其可能的致病機制,為臨床治療提供新的靶點和途徑。本課題擬進行以下三部分研究:
　　(1)觀察嚴重燙傷早期大鼠脛骨前肌消耗改變
　　(2)篩選大鼠嚴重燙傷早期脛骨前肌微小RNA表達譜并進行生物信息學分析
　　(3)篩選嚴重燙傷大鼠早期脛骨前肌長鏈非編碼RNA表達譜并進行生物信息學分析
　　方法:
　　(1)采用雄性Wistar大鼠制備燙傷大鼠模

4、型,實驗組大鼠采用94℃熱水、12s造成大鼠背部30％TBSA三度燙傷,對照組大鼠采用37℃溫水(其余條件同實驗組)。分別于傷后1d、3d、7d、14 d(n=8)麻醉處死大鼠,分離獲取脛骨前肌,稱量肌肉重量。原位末端轉(zhuǎn)移酶標記(TUNEL)法測定脛骨前肌細胞凋亡。同時留取脛骨前肌標本用于微小RNA和長鏈非編碼RNA的檢測。
　　(2)采用丹麥鎖核苷酸技術(shù)Exiqon miRCURY? LNA microRNA芯片(第七代),約7

5、00條捕獲探針,數(shù)據(jù)庫版本為v18.0,檢測(1)中留取的實驗組與對照組中傷后3天的脛骨前肌標本(n=4),對部分差異microRNAs進行實時定量PCR驗證以檢驗芯片數(shù)據(jù)的可靠性;對篩選出的部分差異 microRNAs進行靶基因預測、聚類分析、基因功能分析(GO analysis)、信號通路分析(Pathway)等生物信息學分析,對部分。
　　(3)采用Arraystar公司Rat LncRNA Array(4x44K, Arr

6、aystar)大鼠長鏈非編碼RNA芯片,設(shè)計包括LncRNAs和蛋白編碼基因,約來自于NCBI RefSeq數(shù)據(jù)庫的9000個lncRNAs和UCSC數(shù)據(jù)庫的約15000個mRNA。檢測(1)留取的實驗組與對照組中傷后3天的脛骨前肌標本(n=3),對部分差異LncRNAs進行實時定量PCR驗證以檢驗芯片數(shù)據(jù)的可靠性;對篩選出的差異 LncRNAs進行基因功能分析(GO analysis)、信號通路分析(Pathway)、CNC網(wǎng)絡(luò)分析等

7、生物信息學分析。
　　結(jié)果:
　　(1)在相同時間點和對照組相比,脛骨前肌重量及其與體重比值在嚴重燙傷大鼠傷后3d即出現(xiàn)下降,7d下降達到最低;體現(xiàn)出明顯的骨骼肌消耗狀態(tài)。傷后燙傷大鼠脛骨前肌細胞凋亡增加。
　　(2)燙傷組與對照組相比,共有69種miRNA呈現(xiàn)差異表達,其中升高的miRNA有4種,降低的miRNA有65種;經(jīng)過GO分析顯示,參與代謝過程相關(guān)的miRNA包括6種,參與生物調(diào)節(jié)相關(guān)的miRNA包括5種。P

8、ATHWAY分析顯示關(guān)系密切的研究通路有P53信號通路、凋亡信號通路、PI3K/Akt信號通路等。
　　(3)長鏈非編碼RNA芯片數(shù)據(jù)顯示,從約15000個大鼠mRNAs中檢測實驗組與對照組之間的差異mRNAs,發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組相比,顯著升高的共有93個,而降低的則有110個。從約9000個大鼠 lncRNAs中檢測實驗組與對照組之間的差異lncRNAs,發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組相比,升高的共有64個,而降低的則有53個,且倍數(shù)大于1

9、.5(P<0.05)。GO分析顯示生物過程的負調(diào)控、補體激活的經(jīng)典途徑、電壓門控氯離子通道活性等多種功能與長鏈非編碼RNA相關(guān)。PATHWAY分析顯示胰島素信號通路、T細胞受體信號通路等信號通路可能受到長鏈非編碼RNA調(diào)控。
　　結(jié)論:
　　(1)大鼠嚴重燙傷后早期脛骨前肌microRNAs表達譜產(chǎn)生改變,且生物信息學分析 microRNAs可能主要參與了調(diào)控代謝過程、生物調(diào)節(jié)等多種功能,并參與 P53信號通路、凋亡信號通路