PPRV全長(zhǎng)基因克隆及H蛋白與SLAM受體相互作用的研究.pdf

1、小反芻獸疫(peste des petits ruminants，PPR)是小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminantsvirus，PPRV)感染小反芻動(dòng)物而引起的一種急性傳染病，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、口炎、腹瀉和肺炎等特征，發(fā)病過(guò)程以高發(fā)病率和高死亡率為特征。我國(guó)西藏阿里地區(qū)于2007年首次暴發(fā)，近兩年，新疆、內(nèi)蒙古自治區(qū)、遼寧、山東、湖南、安徽、廣西、云南、貴州等地相繼發(fā)生疫情，小反芻獸疫防控任務(wù)十分嚴(yán)峻，有效防控

2、小反芻獸疫的相關(guān)生物制品的研發(fā)勢(shì)在必行。但截至目前，有效預(yù)防國(guó)內(nèi)PPR的疫苗還有待于進(jìn)一步研究。因此，建立PPRV的反向遺傳學(xué)技術(shù)操作平臺(tái)就顯得十分重要。國(guó)內(nèi)外學(xué)者為深入了解本病的發(fā)病機(jī)理，為新型載體疫苗的研制提供基礎(chǔ)，開(kāi)展了PPRV感染性克隆的相關(guān)研究工作。
　　本研究結(jié)合當(dāng)前副黏病毒科病毒感染性克隆和麻疹病毒感染性克隆的研究方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)pBluescript(R)Ⅱ KS(+)載體和pVAX1載體的改造，獲得可作為通用

3、型負(fù)鏈不分節(jié)段RNA病毒的反向遺傳載體，pBKS-HDV載體和pVAX1-HDV載體。在pBKS-HDV載體基礎(chǔ)上構(gòu)建了基于T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子的含病毒基因組全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒pBKS-PPRV Nigeria75/1，在pVAX1-HDV載體基礎(chǔ)上構(gòu)建了基于CMV啟動(dòng)子的含病毒基因組全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒pVAX1-PPRV Nigeria75/1。以病毒全長(zhǎng)cDNA為基礎(chǔ)獲得了輔助性質(zhì)粒PCI-N、PCI-P和PCI-L。為能成功拯

4、救PPRV全長(zhǎng)cDNA，以EGFP報(bào)告基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建了微基因組pKS-LGT、pKS-HAM-TGL、PTVT-LGT和PTVT-HAM-TGL。通過(guò)將微基因組與輔助性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方式摸索病毒拯救的條件，以此來(lái)驗(yàn)證輔助性質(zhì)粒的有效性，極大提高了全長(zhǎng)病毒的拯救成功率。為實(shí)現(xiàn)利用RNA聚合酶Ⅱ拯救系統(tǒng)拯救PPRV病毒，則需要穩(wěn)定表達(dá)病毒受體的細(xì)胞系為基礎(chǔ)。因此，本研究成功克隆出綿羊SLAM基因，通過(guò)對(duì)遺傳抗性的篩選，成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)綿羊SL

5、AM受體的細(xì)胞系，為實(shí)現(xiàn)RNA聚合酶Ⅱ拯救系統(tǒng)拯救PPRV病毒奠定了基礎(chǔ)。
　　為深入了解H蛋白與PPRV病毒致病性的關(guān)系，通過(guò)生物信息學(xué)的方法建立了PPRV Nigeria75/1克隆株、PPRV Nigeria75/1疫苗株和Tibet07株H蛋白與人、犬、綿羊SLAM受體相互作用Cartoon圖，利用Cartoon圖的結(jié)果分析了相互作用的位點(diǎn)以及相互作用位點(diǎn)的差異性。為驗(yàn)證H蛋白可與SLAM受體發(fā)生相互作用，構(gòu)建了PPRV

6、Nigeria75/1克隆株和Tibet07株H蛋白胞外區(qū)表達(dá)質(zhì)粒和綿羊SLAM胞外區(qū)表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)和Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)PPRVNigeria75/1克隆株和Tibet07株H蛋白可以與綿羊SLAM受體發(fā)生相互作用。上述研究工作為進(jìn)一步了解PPRV Nigeria75/1克隆株和Tibet07株H蛋白與SLAM受體結(jié)合后對(duì)病毒致病性的影響機(jī)制，精確定位H蛋白與綿羊SLAM受體相互作用位點(diǎn)，并在其基礎(chǔ)上借助PPRV感染性克