經(jīng)冠脈自體骨髓單個核細胞移植修復梗死心肌的實驗觀察.pdf

1、背景：心肌梗死（MI）是心肌的急性壞死，病情兇險，病死率高。傳統(tǒng)觀念認為，心肌細胞壞死后不能再生，成纖維細胞增生修復，形成瘢痕組織，并逐步發(fā)生心室重構(gòu)，發(fā)展為頑固性心力衰竭。目前的藥物治療、介入治療和冠脈旁路移植術(shù)能夠恢復一定的血供，但均不能充分補充有效工作的心肌，無法改善MI的遠期預后。近年來，細胞移植治療心肌梗死為重建受損心肌帶來新的希望。雖然相關(guān)基礎(chǔ)實驗及臨床研究比較廣泛，但研究結(jié)果均不一致，存在爭議。細胞移植后的分化問題、細胞移

2、植能否長期持久地改善心臟功能、改善缺血心功能的機制以及細胞移植是否引起心律失常這些問題均不明確。
　　 目的:1.結(jié)扎犬冠狀動脈左前降支建立心肌梗死模型。2.觀察骨髓單個核細胞懸液（BM-MNCs）的制備及經(jīng)冠脈注射的可行性。3.觀察經(jīng)冠脈移植BM-MNCs對梗死后心功能的影響。4.觀察熒光染料CM-DiI標記BM-MNCs的效率及熒光在體的時間。5.觀察標記的BM-MNCs能否在梗死心肌內(nèi)存活并且分化成為心肌樣細胞。6.觀察B

3、M-MNCs移植對血管形成的影響及對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）mRNA表達的影響。7.觀察BM-MNCs移植后心肌的有效不應期有無改變。8.觀察BM-MNCs移植有無導致惡性心律失常發(fā)生的潛在風險。9.觀察BM-MNCs移植后能否糾正縫隙連接排列紊亂而減少心律失常的發(fā)生。
　　 方法:1.雜種犬16只，隨機分為移植組（n=10）和對照組（n=6）兩組，結(jié)扎冠

4、狀動脈前降支建立犬心肌梗死模型。2.移植組的實驗犬全麻后無菌條件下于髂前/后上嵴抽取骨髓25-30ml，ficoll淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離得BM-MNCs，CM-DiI標記待移植的BM-MNCs，用倒置相差熒光顯微鏡觀察細胞數(shù)目和標記效率，調(diào)整細胞濃度為3×107-1×108/ml。3.結(jié)扎冠脈后2h恢復血流，于冠脈結(jié)扎點遠端插入套管針，向套管內(nèi)注射制備好的BM-MNCs，對照組移植等量生理鹽水，最后完全結(jié)扎LAD。術(shù)后予抗生

5、素3天，飼養(yǎng)觀察6周。4.所有實驗犬于梗死后2h（細胞移植前）、移植后6周行血流動力學檢查，測量左室收縮壓、左室舒張末壓；以熱稀釋法測量心排血量。5.所有實驗犬于梗死后2h（細胞移植前）、移植后6周進行超聲心動圖檢查，測量左室舒張末內(nèi)徑、左室收縮末內(nèi)徑、左室舒張末容積、左室收縮末容積、射血分數(shù)、短軸縮短率和每搏量。6.移植后6周，氯化鉀注射法處死犬，取梗死區(qū)、梗死周邊區(qū)心肌，觀察CM-DiI示蹤的細胞的分布，免疫熒光染色檢測CM-DiI

6、示蹤的細胞是否表達心肌細胞特異性蛋白-心肌β-肌球蛋白重鏈（cardiac myosin heavy chain，β-MHC）、連接蛋白43（Connexin43，Cx43）。vWF免疫組化染色，計算毛細血管密度。RT-PCR檢測VEGF、bFGF和MMP-9的mRNA表達。7.梗死后6周測定心臟不同部位的有效不應期，免疫組化染色檢測Connexin43的表達。
　　 結(jié)果:1.BM-MNCs經(jīng)CM-DiI標記后，細胞膜著色，紫

7、外光激發(fā)呈現(xiàn)紅色。標記效率為95％-100％。2.細胞移植治療6周后，在BM-MNCs移植治療的犬心肌組織均可見到CM-DiI標記的紅色細胞；細胞移植組的心肌MHC、Connexin43免疫熒光染色均為陽性，呈現(xiàn)綠色熒光；與CM-DiI標記的紅色熒光供體細胞進行疊加，可見β-MHC、Connexin43染色雙陽性的細胞，呈現(xiàn)黃色熒光。3.對照組心肌梗死后6周和心肌梗死后2h比較，各項血流動力學指標均無顯著改善（P>0.05）；而在移植組

8、，細胞移植后6周LVEDP較梗死后2h（細胞移植前）明顯降低，差異有顯著性（5.1±3.07 vs9.2±4.34，P<0.05）；與梗死后6周的對照組比較，LVEDP亦明顯降低，差異有顯著性（5.1±3.07 vs11.67±3.42，P<0.01）。移植組細胞移植后6周CO較心肌梗死后2h（細胞移植前）明顯升高，差異有顯著性（3.1±0.89 vs2.14±0.49，P<0.01）；與梗死后6周的對照組比較，CO亦明顯升高，差異有顯

9、著性（3.1±0.89 vs2.39a：0.43，P<0.05）。余指標無顯著變化（P>0.05）。4.對照組心肌梗死后6周和心肌梗死后2h比較，各項超聲心動指標均無顯著改善（P>0.05）；移植組細胞移植后6周，ESD、ESV、EDV、LVEF、FS、SV均較移植前有明顯改善，與梗死后6周的對照組相比，亦有明顯改善（P<0.05），其中移植組EF較對照組提高7％左右，余指標無顯著變化（P>0.05）。5.BM-MNCs移植后6周，移植

10、組有明顯的血管新生，梗死邊緣區(qū)新生血管數(shù)量，移植組明顯高于對照組（19.32±2.47 vs9.47±1.28，P<0.01），而兩組的梗死中心區(qū)的新生血管數(shù)量無顯著性差異（3.44±0.51 vs3.07±0.3，P>0.05）。6.移植組促血管生長因子VEGF188的mRNA表達水平顯著高于對照組（1.16±0.38 vs0.45±0.15，P<0.01）：移植組VEGF164的mRNA表達水平顯著高于對照組（1.17±0.3 vs

11、0.42±0.17，P<0.01）；移植組促血管生長因子bFGF的mRNA表達水平顯著高于對照組（0.90±0.21 vs0.63+0.28，P<0.05）；移植組基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的mRNA表達水平顯著低于對照組（0.59±0.18 vs0.93±0.3，P<0.05）。7.移植組與對照組相比，梗死6周測得梗死區(qū)、梗死周邊區(qū)和正常區(qū)有效不應期無明顯差別（85±9.26 vs90±7.07ms，P>0.05）（87.78±9.37

12、 vs90±7.07，P>0.05）（85±11.95 vs88.33±9.4，P>0.05）；移植組和對照組正常心肌區(qū)之間Connexin43表達無顯著性差異（3543.7±446.00 vs3431.67+421.54，P>0.05）；移植組梗死邊緣區(qū)Cx43較對照組明顯增多（2312.50±412 vs1356.17±332.73，P<0.05），但仍明顯少于正常區(qū)相應部位（2312.50±412 vs3543.7±446.00，

13、P<0.05）：在梗死中心區(qū)移植組和對照組比較差異無顯著性（327.00±98.67 vs311.33±78.74，P>0.05）。
　　 結(jié)論:1.熒光染料CM-DiI標記BM-MNCs細胞效率高，熒光在活體細胞內(nèi)存在的時間大于6周，可成功示蹤移植的BM-MNCs。2.CM-DiI示蹤的細胞能在梗死心肌內(nèi)存活并且分化成為具有心肌細胞特異性標記-β-MHC的心肌樣細胞，并同時表達Connexin43。3.經(jīng)冠脈內(nèi)注射移植自體BM