槐耳抑制乳腺癌的分子網(wǎng)絡構(gòu)建及53BP1抑癌分子通路研究.pdf

1、目的：
　　乳腺癌是全世界女性常見的惡性腫瘤之一。隨著人們對疾病認識的深入，“乳腺癌是一種全身性疾病”這一論點已被人們廣泛接受，在此認識的基礎上，乳腺癌的治療已發(fā)展成集手術治療、化療、放療、內(nèi)分泌治療及生物靶向治療及中醫(yī)藥治療等多種方式于一體的綜合治療體系。
　　中藥作為乳腺癌系統(tǒng)性輔助治療的一部分，在乳腺癌治療中的應用已引起越來越多的重視。中藥的每種組成成分通常具有多種作用，且各組成成分之間又有復雜的相互作用，因此重要通常

2、為多靶點作用方式，具有辨證性及整體性，在癌癥治療的臨床應用中有其獨到的作用及廣泛的應用前景。
　　槐耳是一種具有抗癌作用的中藥，其正式問世時是作為原發(fā)性肝癌的輔助用藥之一，臨床應用發(fā)現(xiàn)其有明顯的抗肝癌作用，但其作用機制尚不完全明確。隨后，槐耳開始應用在乳腺癌的輔助治療中，且在臨床應用中也表現(xiàn)出其抗癌性。作為中藥的典型代表，槐耳的作用同樣具有辨證性和整體性，因此，對其作用機制的研究也必須從全面、整體的角度出發(fā)，而不能局限在傳統(tǒng)的研究

3、方法中。
　　基因芯片是一種近幾十年間迅速發(fā)展起來的新興技術，利用基因芯片技術可以檢測數(shù)以千計甚至數(shù)以萬計的基因表達信息。利用基因芯片檢測出的基因信息進行深入的數(shù)據(jù)分析，可以深層次挖掘差異基因所涉及的功能及分子信號轉(zhuǎn)導通路，對下一步的深入研究提供指導幫助。
　　因此，本論文的目的就是利用基因表達譜芯片這一技術，對槐耳抑制乳腺癌的作用機制展開全面檢測及分析。利用基因芯片技術，我們將篩選出槐耳作用于乳腺癌細胞所引起的發(fā)生顯著性變

4、化的功能及分子信號轉(zhuǎn)導通路，揭示槐耳抑制乳腺癌的分子機制，并為后續(xù)深入研究提供指導。同時，我們也將定位在槐耳抑制乳腺癌中起到關鍵作用的基因，并對其功能和作用機制展開深入研究，力求為乳腺癌的新藥研發(fā)提供新的靶點。
　　方法：
　　為了研究槐耳抑制乳腺癌細胞的具體作用機制，我們首先用MTT的實驗方法檢測了槐耳對乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞抑制作用，并根據(jù)MTT的實驗結(jié)果選擇適宜的藥物作用濃度和作用時間，以

5、刺激乳腺癌細胞。然后，從經(jīng)槐耳刺激的乳腺癌細胞中提取RNA，進行基因表達譜芯片的檢測。從芯片結(jié)果中，利用倍數(shù)法的方法初步篩選出表達差異基因，并用實時定量PCR的方法對芯片中的部分結(jié)果進行驗證。然后通過Gene Ontology(GO)分析對表達差異基因參與的生物學功能進行研究，通過Pathway分析對表達差異基因參與的分子信號轉(zhuǎn)導通路進行分析。最后，將GO分析得到的有顯著變化的差異基因和Pathway分析得到的差異基因取交集，在Kyot

6、o Encyclopedia of Genes andGenomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫的指導下，將交集基因繪制成能夠直觀反映變化的關鍵基因的基因間相互作用網(wǎng)絡圖，從而揭示槐耳作用于乳腺癌細胞的多靶點作用方式。
　　在基因芯片結(jié)果的提示下，我們通過Western blot和實時定量PCR的方法，對潛在的關鍵抑癌基因53BP1的表達變化進行了檢測。為了拓展研究53BP1的基因功能，我們通過構(gòu)建載體和細胞轉(zhuǎn)染等方法，篩選出53BP1過表

7、達及干擾的乳腺癌細胞系進行后續(xù)研究。我們通過細胞形態(tài)觀察、Western blot、實時定量PCR和細胞免疫熒光化學等實驗方法，檢測篩選出的乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）標志性分子的表達變化。然后，用Transwell的實驗方法探究53BP1對乳腺癌細胞系遷移和侵襲能力的影響。為了明確53BP1抑制乳腺癌細胞EMT的具體作用機制，我們采用Western blot和實時

8、定量PCR的方法，對可能的信號通路進行了檢測。為明確通路中microRNA（miRNA）的作用，我們向細胞中轉(zhuǎn)染miRNA mimic及miRNA inhibitor，然后用Westemblot和Transwell實驗來驗證miRNA在53BP1抑制乳腺癌細胞EMT過程中的作用機制。在體內(nèi)實驗水平，我們構(gòu)建了裸鼠皮下成瘤模型，用免疫組織化學的實驗方法檢測腫瘤組織中EMT關鍵分子的表達情況，來驗證體外實驗的結(jié)果。最后，我們用實時定量PCR

9、的方法，在臨床手術標本組織中檢測了53BP1、 miRNA和ZEB1等關鍵分子的表達，來進一步明確我們的實驗結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　MTT實驗結(jié)果顯示，隨著槐耳溶液藥物濃度和作用時間的增加，兩種乳腺癌細胞的存活數(shù)量均越來越少，即槐耳對乳腺癌細胞系的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性和時間依賴性。根據(jù)MTT的實驗結(jié)果，我們選擇用8mg/mL的槐耳溶液刺激乳腺癌細胞72h，然后進行基因芯片的檢測。
　　首先，倍數(shù)法初步篩選表達

10、差異基因的結(jié)果顯示，經(jīng)槐耳刺激后，MDA-MB-231細胞系中差異基因共有1655個，其中有907個基因表達上升，748個基因表達下降;而MCF-7細胞系中差異基因共有1320個，其中表達上調(diào)的有600個，表達下調(diào)的有720個。在兩種乳腺癌細胞系中，槐耳共同調(diào)節(jié)的差異基因共有172個，其中98個發(fā)生上調(diào)，74個發(fā)生下調(diào)。為了驗證基因表達譜芯片結(jié)果的可信度，我們用實時定量PCR的方法對結(jié)果中的部分基因結(jié)果進行了驗證，結(jié)果顯示實時定量PCR

11、的結(jié)果與芯片結(jié)果基本相符。
　　然后，我們根據(jù)芯片結(jié)果進行了生物功能學水平的GO分析。結(jié)果顯示在MDA-MB-231細胞中，共有562個GO功能發(fā)生顯著差異，其中353個GO功能發(fā)生上調(diào)，209個GO功能發(fā)生下調(diào);而在MCF-7細胞中，共有695個GO功能發(fā)生顯著差異，其中307個GO功能發(fā)生上調(diào)，388個GO功能發(fā)生下調(diào)。兩種乳腺癌細胞系受槐耳共同調(diào)節(jié)的GO功能共有129個，其中77個發(fā)生上調(diào)，52個發(fā)生下調(diào)。
　　然后，

12、我們從信號轉(zhuǎn)導通路水平進行了Pathway分析，分析結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細胞中，槐耳顯著調(diào)節(jié)信號通路104條，其中59個通路上調(diào)，45個通路發(fā)生下調(diào);在MCF-7細胞中，共有77條通路發(fā)生了顯著變化，其中39條發(fā)生上調(diào)，38條發(fā)生下調(diào)。通過將兩種細胞系發(fā)生顯著變化的通路取交集，我們發(fā)現(xiàn)，共有36條通路發(fā)生變化，其中8條上調(diào)，28條下調(diào)。
　　最后，我們分別對MDA-MB-231細胞、MCF-7細胞發(fā)生變化的關鍵基因構(gòu)建

13、了其分子網(wǎng)絡圖，并將兩種細胞系共同發(fā)生變化的分子網(wǎng)絡圖進行了繪制，最終得出了槐耳調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的重要分子網(wǎng)絡。
　　在芯片結(jié)果的提示下，我們發(fā)現(xiàn)，槐耳作用于乳腺癌細胞后，DNA損傷修復過程中的關鍵基因53BP1發(fā)生了明顯上調(diào)，這一結(jié)果與其它DNA損傷修復通路中的基因變化不符。根據(jù)我們的前期研究結(jié)果，我們推測在槐耳抑制乳腺癌細胞這一過程中，53BP1發(fā)揮了抑癌基因的功能，因此我們對53BP1基因展開了拓展性研究。
　　在對篩選

14、出的過表達和干擾53BP1的乳腺癌細胞的培養(yǎng)中，我們發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，這一變化提示53BP1可能抑制了乳腺癌細胞的EMT過程，為了明確這一假設，我們檢測了EMT過程中的關鍵分子，發(fā)現(xiàn)53BP1確實能夠抑制乳腺癌細胞EMT的發(fā)生。同時，我們發(fā)現(xiàn)53BP1能夠顯著抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲能力。為了進一步研究其作用機制，我們檢測了EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達變化，發(fā)現(xiàn)ZEB1的表達發(fā)生了顯著改變，提示53BP1可能通過調(diào)節(jié)ZEB1從而實

15、現(xiàn)對EMT的抑制作用。miRNA在乳腺癌的EMT過程中發(fā)揮重要作用，而ZEB1又是miR-200家族發(fā)揮作用的靶基因，因此，我們檢測了miR-200家族5個miRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-200b和miR-429發(fā)生了最為顯著的變化。然后我們在高表達miRNA的細胞中干擾miRNA，在低表達miRNA的細胞中過表達相應的miRNA，發(fā)現(xiàn)53BP1所引起的變化均發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，提示53BP1確實通過調(diào)節(jié)miR-200b-429/ZEB1/E

16、-cadherin這一信號通路實現(xiàn)對EMT和遷移侵襲能力的抑制。最后，我們從體內(nèi)實驗水平和臨床標本水平驗證了體外實驗的結(jié)果。
　　結(jié)論：
　　1.槐耳對乳腺癌細胞有明顯的抑制作用。
　　2.槐耳對乳腺癌的抑制作用呈現(xiàn)多靶點、整體性的特點，涵蓋乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中多個重要生物學功能及分子信號轉(zhuǎn)導通路。
　　3.槐耳能夠上調(diào)抑癌基因53BP1的表達。
　　4.53BP1能夠通過調(diào)節(jié)miR-200b-429/ZE

17、B1/E-cadherin通路抑制乳腺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和浸潤轉(zhuǎn)移。
　　意義：
　　1.用基因表達譜芯片的方式，揭示了槐耳對乳腺癌細胞的多靶點作用方式，為槐耳治療乳腺癌提供基礎實驗證據(jù)，并為今后對槐耳作用機制的研究提供指導方向。
　　2.從槐耳抑制乳腺癌的基因表達譜芯片中篩選出抑癌基因53BP1，為新藥開發(fā)提供了新的靶點。
　　3.研究了53BP1通過miR-200b-429/ZEB1/E-cadherin通