槐耳通過lncRNA-H19抑制乳腺癌進展的分子機制研究.pdf

1、研究背景：
　　乳腺癌是全球女性最為常見的惡性腫瘤之一，它也是女性患者中死亡率最高的癌癥類型。我國每年的女性乳腺癌新診斷病例數約占全世界的12.2％，因乳腺癌而死亡的女性患者約占全世界的9.6％。研究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制，尋求安全有效的治療方法是臨床醫(yī)學工作者和基礎醫(yī)學研究人員迫切需要解決的問題。
　　近年來，隨著人們對“乳腺癌是一種全身性疾病”這一觀點的普遍接受，集手術治療、放療、化療、內分泌治療、中醫(yī)藥治療、生

2、物治療、靶向治療等為一體的綜合性治療體系逐漸形成。隨著腫瘤學臨床研究和基礎研究的進展，乳腺癌的各種療法無論在安全性還是在治療效果上都有所改進，但近年來全球乳腺癌的發(fā)病率和死亡率仍在逐步上升，在臨床應用中也存在諸多問題，例如價格昂貴、耐藥性的產生及全身毒副作用等。因此尋求一種毒副作用小、耐藥性低且安全有效的藥物應用于乳腺癌的臨床治療是亟待解決的問題。中藥作為一種來源于藥用草本植物的天然藥物及其加工代用品，因其毒性相對較低、價格相對適中、療

3、效確切等優(yōu)點引起了醫(yī)學工作者的廣泛關注，逐漸成為乳腺癌系統(tǒng)性輔助治療中的重要組成部分。一些中藥制劑在癌癥的治療中可以增強患者對其他療法的敏感性，延長患者的生存期，提高機體免疫力及生活質量，有良好的臨床應用前景。
　　槐耳是一種生長在樹干上的棕褐色藥用真菌，在我國應用于疾病治療已經有一千六百余年的歷史。有越來越多的證據表明，槐耳在乳腺癌、結直腸癌、肝癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌等多種癌癥類型中有良好的治療作用。我們團隊在前期研究中證實了

4、槐耳清膏可以通過抑制乳腺癌細胞增殖及轉移、抑制腫瘤血管新生、誘導乳腺癌細胞凋亡及自嗜、調節(jié)腫瘤特異性免疫等多種機制發(fā)揮抗癌作用。對槐耳抗癌療效分子機制的研究發(fā)現，槐耳對p53通路、pAKT/mTOR/S6通路、JNK/P38信號通路、ER/NF-kB通路、Wnt/β-catenin通路、PI3KK/AKT通路等重要的信號通路都有調控作用。然而，槐耳潛在治療機制還有待進一步的研究。
　　長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類由200

5、個以上核苷酸組成的RNA分子。LncRNA雖然不具備蛋白質編碼功能，但可以通過轉錄調節(jié)、轉錄后調節(jié)、表觀遺傳學修飾等多種方式對基因的表達進行調控，從而對多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展產生影響。近年來lncRNA在癌癥發(fā)生發(fā)展中的重要作用已被大量研究所證實，為lncRNA在臨床診斷和靶向治療中的應用奠定了基礎。例如在前列腺癌中高特異性表達的新型前列腺癌抗原3（PCA3，又稱DD3），是最早發(fā)現的與癌癥相關的lncRNA之一，現已作為前列腺癌輔助診

6、斷的生物標記分子應用于臨床。因此對lncRNA在癌癥中發(fā)揮的調節(jié)作用及機制的研究具有重要意義。目前還沒有對lncRNA是否在槐耳的抗腫瘤功能中起介導作用的報道，因此我們從lncRNA入手探索槐耳抗癌作用的潛在機制，利用分子生物學技術，闡述槐耳清膏對乳腺癌細胞抑制作用的可能機制，為槐耳治療乳腺癌提供藥理學依據。
　　研究目的：
　　1.探討經槐耳處理與未處理的乳腺癌細胞，利用基因芯片分析兩組細胞系中差異表達的基因;
　　

7、2.探討lncRNA-H19在槐耳的抗癌療效中發(fā)揮的作用和潛在的分子機制。
　　研究方法：
　　1.細胞培養(yǎng)
　　本研究中使用的MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7乳腺癌細胞系均培養(yǎng)在含10％胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)，2-3天傳一次代。
　　2.差異基因的分析
　　本研究中，我們利用接受與未接受槐耳處理的乳腺癌細胞提取總RNA，然后反轉成cDNA，

8、送至Affymetrix公司進行芯片雜交處理。我們利用該公司提供的專業(yè)分析軟件，分析該公司提供的原始數據，利用倍數法分析槐耳組和未接受槐耳組細胞系中差異表達的基因。
　　3.基因功能顯著性分析(G0分析):
　　將分析出的差異表達的基因與G0數據庫進行對比，并對每個基因的功能進行注釋，最終得到每個基因所參與的功能，基于每個G0功能中發(fā)生變化的基因數目以及Fisher檢驗差異顯著性的p值，挑選出變化最為顯著的20個G0功能，并

9、繪制G0功能的分布圖。
　　4.差異基因參與的信號通路分析(Pathway分析)
　　利用公司提供的專業(yè)軟件，基于KEGG信號通路數據庫，將每個基因所參與的信號傳導通路進行注釋?；诿總€Pathway中發(fā)生變化的基因數目以及Fisher檢驗差異顯著性的p值，挑選出變化最為顯著的20個Pathway，并繪制Pathway的分布圖。
　　5.差異基因所參與通路的網絡分析
　　根據上述結果所示的差異基因及其所參與的通路

10、注釋，利用專業(yè)的分析軟件，繪制差異通路的網絡圖。其中紅色代表通路激活，藍色代表通路抑制，黃色代表通路中的基因既有上調也有下調。
　　6.實時定量PCR(qPCR)
　　我們利用Trizol處理乳腺癌細胞，提取總RNA，然后利用購買的反轉錄試劑盒將RNA反轉成cDNA或microRNA，進行實時定量PCR(qPCR)實驗，分別檢測了槐耳提取物對lncRNA-H19和miR-675-5p表達水平的影響。
　　7.質粒擴增提

11、純
　　我們將lncRNA-H19的cDNA克隆至pcDNA3.1載體的多克隆位點，獲得lncRNA-H19的過表達質粒。將適量質粒轉化至感受態(tài)的大腸桿菌，將其涂布到含氨芐抗生素的LB培養(yǎng)板上，過夜培養(yǎng)12-16h。挑取培養(yǎng)板上的單克隆菌落置于含氨芐抗生素的LB培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)使菌落擴增，過夜培養(yǎng)1216h。利用購買的無內毒素質粒大提試劑盒進行質粒的提取。
　　8.細胞轉染
　　將擴增提純的lncRNA-H19過表達質

12、粒、找生物技術公司合成的lncRNA-H19的siRNA或miR-675-5p的mimics和inhibitor，與一定量的脂質體2000混合，按照操作程序加至細胞中，調控相應基因的表達量，以進行后續(xù)的功能與機制研究。
　　9.MTT實驗
　　將經過細胞轉染的乳腺癌細胞種到7個96孔細胞培養(yǎng)板中，分別經槐耳處理0，1，2，3，4，5，6天后，向細胞中加入MTT溶液，利用酶標儀讀取490nm處的吸光度值，從而檢測過表達或抑制l

13、ncRNA-H19和miR-675-5p對乳腺癌細胞槐耳提取物敏感性的影響。
　　10.流式細胞術
　　將經過轉染和槐耳處理的細胞進行Annexin V-FITC/PI染色，利用流式細胞儀檢測凋亡細胞的比例，從而檢測過表達或抑制lncRNA-H19和miR-675-5p是否對槐耳提取物誘導乳腺癌細胞凋亡的能力產生影響。
　　11.Western Blot
　　按照操作程序將細胞裂解，提取細胞總蛋白。然后進行SDS

14、-PAGE電泳，隨后進行轉膜、封閉、一抗孵育及二抗孵育處理，最后利用化學發(fā)光試劑顯示miR-675-5p的下游蛋白CBL的表達量以確定其是否在槐耳的抑癌功能中發(fā)揮介導作用。
　　研究結果：
　　1.我們的結果顯示，在經過8mg/ml槐耳溶液刺激72h后，共有1116個lncRNAs發(fā)生了顯著的變化。其中有211個lncRNAs發(fā)生了上調，905個發(fā)生了下調。
　　2.G0分析顯示，在經過槐耳刺激后，共有129個主要的G

15、0功能發(fā)生了變化，其中77個功能發(fā)生了上調，52個G0功能發(fā)生下調;Pathway分析顯示，共有109個pathway發(fā)生了顯著改變，其中有59個發(fā)生了上調，50個發(fā)生了下調;我們利用芯片數據構建了槐耳作用的分子通路圖。
　　3.槐耳提取物可以降低lncRNA-H19和miR-675-5p的表達，過表達LncRNA-H19和miR-675-5p可以抑制槐耳提取物的細胞毒作用。
　　4.lncRNA-H19和miR-675-5

16、p表達水平的降低可以促進槐耳提取物的抑癌作用，增加乳腺癌細胞對槐耳提取物的敏感性。
　　5.槐耳提取物處理乳腺癌細胞后能上調miR-675-5p下游蛋白CBL的表達水平。
　　研究結論：
　　1.槐耳具有多靶點的作用方式，可以通過抑制細胞周期進展、促進細胞凋亡等多種途徑影響乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展。
　　2.槐耳可以對lncRNA的表達產生調控作用，槐耳可以通過lncRNA-H19/miR-675-5p/CBL途徑抑制