下調Cullin7抑制乳腺癌侵襲轉移及其分子機制的研究.pdf

1、背景：乳腺癌在世界范圍內是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，遠處轉移是導致患者死亡的主要原因。乳腺癌患者一旦發(fā)生遠處轉移，生存率將明顯下降。探討乳腺癌轉移的分子機制，是目前乳腺癌研究的熱點之一。上皮-間質轉變（Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞形態(tài)向間充質細胞轉變，通過 EMT腫瘤細胞獲得遷移運動能力，業(yè)已證明 EMT與腫瘤轉移密切相關。
　　當前已有大量研究證實，Cullin7

2、與肺癌、肝癌及黑色素細胞瘤等惡性腫瘤的形成密切相關，在前期研究中，我們通過外顯子測序法篩選出乳腺轉移候選基因Cullin7，在后續(xù)研究中利用免疫組化法在蛋白水平證實Cullin7對乳腺癌發(fā)生、進展和轉移的有促進作用，但Cullin7如何引起乳腺癌發(fā)生、進展和轉移，目前仍未有相關明確的報告。研究表明泛素化蛋白酶系統(tǒng)的紊亂與腫瘤的形成密切相關，Cullin蛋白作為泛素化蛋白酶E3 Skp-Cullin-F-box（SCF）的重要組成結構，它

3、能特異性識別底物，介導蛋白質泛素化過程。Cullin家族成員包括 Cullin1、Cullin2、Cullin3、Cullin4A、Cullin4B、Cullin5和Cullin7，Cullin7作為 Cullin家族的一員，它與Skp1，Fbx29和Roc1構成E3復合物，參與細胞間信號傳導、細胞周期進程、細胞增殖及凋亡等過程。與 Cullin7擁有相似結構和功能的Cullin4A表達上調導致乳腺癌的上皮-間質轉化（EMT，Epith

4、elial-Mesenchymal Transition），我們假設在Cullin7也存在著類似促轉移的分子機制在乳腺癌轉移中扮演的角色。
　　本實驗將利用半定量RT-PCR技術測定在乳腺癌患者的正常組織、腫瘤原發(fā)病灶和腋窩淋巴結轉移病灶中Cullin7的mRNA表達量；利用瞬時轉染技術、半定量RT-PCR技術和細胞劃痕、遷移和侵襲實驗探討Cullin7基因與腫瘤侵襲遷移能力的關系；最后，運用半定量RT-PCR和Western B

5、lot技術探討Cullin7基因與轉移密切相關的EMT信號通路下游靶基因的關系，在不同研究水平上探討Cullin7通過調控EMT信號通路影響乳腺癌轉移的可能。
　　目的：在轉錄水平研究Cullin7基因與乳腺癌發(fā)生、進展和轉移的關系，用乳腺癌細胞株MDA-MB-435s作用實驗物探討Cullin基因影響機制，細胞侵襲和轉移行為關系，以及研究其分子生物學機制，在mRNA和蛋白質、細胞和分子水平證實Cullin7基因可能通過調控EMT

6、通路對乳腺癌侵襲促進轉移的作用以及可能機制。
　　材料和方法：
　　1.標本和細胞
　　收集廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺腫瘤外科2011年7月~2013年7月期間經我院病理確診并行手術治療標本，正常乳腺組織13例，取自乳腺癌患者患側乳房的正常乳腺組織，乳腺浸潤性癌68例，包括浸潤性潤性導管癌57例，浸潤性小葉癌4例，特殊型浸潤性導管癌7例（髓樣癌4例，粘液腺癌3例）?；颊呔鶠榕?，年齡30-86歲之間，平均51.6歲，

7、中位年齡50.5歲。其中乳腺癌患者，≤50歲34例，>50歲34例。Ⅰ期：19例，ⅡA期：8例，ⅡB期：13例，ⅢA期：11例，ⅢB期：3例，ⅢC期：14例。39例已發(fā)生淋巴結轉移，29例無淋巴結轉移。所有患者術前均未進行化療、放療及內分泌治療。人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、 MDA-MB-435s、MCF-7、SK-BR-3、BT549及BT-474均購買于美國ATCC公司，復蘇后培養(yǎng)2~3代用于本實驗。
　　2.方法

8、r>　　2.1采用半定量 RT-PCR法檢測乳腺癌患者正常組織、原發(fā)病灶以及腋窩淋巴結轉移灶中Cullin7 mRNA的表達量，分析各組織中Cullin7 mRNA表達的差異，并探討Cullin7 mRNA與乳腺癌患者臨床病例特征、免疫組化以及臨床因素的關系，采用兩組或多組獨立樣本的Mann-Whitney秩和檢驗分析了不同乳腺組織中Cullin7 mRNA表達差異；相關性檢驗采用Spearman相關分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義

9、。
　　2.2采用半定量RT-PCR法檢測乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435s、MCF-7、SK-BR-3、BT549及BT-474中Cullin7、E-cadherin、Vimentin和GAPDH mRNA表達水平，采用瞬時轉染法將Cullin7 siRNA轉染至人乳腺癌細胞株MDA-MB-435s，并篩選出低表達Cullin7的細胞株。利用倒置顯微鏡觀察轉染后細胞形態(tài)的改變，并使用細胞劃痕實驗、細胞侵襲和

10、遷移實驗明確Cullin7對人乳腺癌細胞體外遷移運動和侵襲能力的影響。
　　2.3采用半定量RT-PCR和Western Blot法檢測人乳腺癌細胞株MDA-MB-435s在Cullin7 siRNA轉染后EMT信號通路相關分子的表達情況，以探討Cullin7對EMT信號通路的調控作用。
　　結果：
　　1. Cullin7 mRNA在乳腺癌患者正常組織、乳腺癌患者癌組織及和乳腺癌患者腋窩淋巴結轉移灶中的表達水平分別為

11、1.2836±0.39839、1.8430±0.86894、2.2962±0.80598，表明Cullin7在乳腺癌患者癌組織和腋窩淋巴結轉移灶內的表達明顯高于乳腺癌患者的正常組織，且在淋巴結轉移灶內升高更明顯。另外，乳腺癌患者癌組織Cullin7 mRNA的表達水平與有無家族病史呈正相關（p≤0.05）。乳腺癌患者淋巴結轉移灶的 Cullin7 mRNA表達水平與淋巴結分期呈正相關（p≤0.05）。
　　2.利用Cullin7

12、siRNA轉染得到低表達Cullin7的人乳腺癌細胞株MDA-MB-435s，siRNA與陰性對照組相比，MDA-MB-435s/siRNA細胞形態(tài)從間質型逆轉為上皮型，體外遷移運動和侵襲能力明顯降低。
　　3.RT-PCR結果顯示MDA-MB-435s/siRNA細胞中EMT通路轉錄因子Snail、Slug、Twist和Zeb-2表達明顯下降(P<0.01)，間質標志物N-cadherin表達明顯下調(P<0.05)；Weste

13、rn Blotting結果表明EMT通路轉錄因子Snail和Slug蛋白表達明顯下降(P<0.01)，間質標志物Vimentin和N-cadherin的蛋白水平明顯下調(分別為P<0.01和P<0.05)。
　　結論：
　　1.乳腺癌患者腋窩淋巴結轉移灶中Cullin7 mRNA的表達水平顯著高于乳腺癌患者癌組織和乳腺癌患者正常組織，乳腺癌患者癌組織顯著高于乳腺癌患者正常組織。這提示Cullin7 mRNA高表達在乳腺癌的形

14、成和轉移中起促進作用，提示 Cullin7有可能作為乳腺癌轉移的相關候選基因。另外，乳腺癌患者癌組織Cullin7 mRNA的表達水平與有家族病史呈正相關。乳腺癌患者淋巴結轉移灶的Cullin7 mRNA表達水平與淋巴結分期呈正相關。實驗結果表明Cullin7高表達人群患乳腺癌的風險高于普通人群，也提示了Cullin7高表達乳腺癌患者擁有較差的預后。
　　2.通過RNA干擾方法使Cullin7基因表達下調，在體外實驗證實轉染后腫瘤