定向誘導(dǎo)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)糖尿病胰島的修復(fù)作用.pdf

1、第一部分：胰腺干細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的研究
　　目的：干細(xì)胞是機(jī)體及其各種組織細(xì)胞的初始來源，其最為顯著的生物學(xué)特征是既有自我更新和不斷增殖的能力,又有多向分化的潛能。干細(xì)胞根據(jù)不同來源可分為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem,ES）、誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem,iPS）及成體干細(xì)胞。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells,B

2、MSC）是骨髓中除了造血干細(xì)胞之外的另一大類干細(xì)胞，體外培養(yǎng)形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣，近年來發(fā)現(xiàn)還可以分化成許多種類的組織細(xì)胞，如中胚層的軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞；外胚層的神經(jīng)元細(xì)胞；內(nèi)胚層的肝卵圓細(xì)胞等。越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示 BMSC還有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、促進(jìn)血管新生、營(yíng)養(yǎng)等作用，與胚胎干細(xì)胞或其他組織特異的干細(xì)胞相比，間充質(zhì)干細(xì)胞有許多優(yōu)勢(shì)，如容易獲得、少倫理限制和低免疫原性。這使得BMSC成為一種在組織工程、再生醫(yī)學(xué)和

3、自身免疫疾病治療方面理想的種子細(xì)胞。然而直接移植BMSC往往由于靶向性不足而使得治療效果不佳。
　　胰腺干細(xì)胞（pancreatic stem cells,PSCS）是一類存在于胎兒和成年胰腺組織中的成體干細(xì)胞，是保持著未達(dá)終末分化狀態(tài)的具有自我更新和多分化潛能的細(xì)胞。由于胰腺干細(xì)胞來源十分匱乏，并且存在免疫排斥等問題，且直接移植或者誘導(dǎo)其形成類胰島樣細(xì)胞團(tuán)后移植，治療效果也不理想。
　　本實(shí)驗(yàn)采用PSCS與BMSC共培養(yǎng)方

4、法，以期定向誘導(dǎo)BMSC向胰腺細(xì)胞的方向分化，為其在糖尿病中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
　　用光鏡觀察原代分離培養(yǎng)的BMSC和 PSCS細(xì)胞形態(tài)，用流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光法鑒定BMSC和PSCS，RT-PCR和免疫熒光法檢測(cè)BMSC誘導(dǎo)前后的定向分化標(biāo)志基因，以探討 PSCS對(duì) BMSC定向誘導(dǎo)分化的效果。
　　方法：
　　1原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)
　　采用全骨髓貼壁法，分離培養(yǎng)原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。麻醉處死SD大鼠（

5、約80g），將股骨取出，放入裝有PBS的平皿中，沖洗3次。剪除股骨近端骨骺，用5 mL注射器吸取5％FBS-MSCM培養(yǎng)基，從遠(yuǎn)端骨骺洞隙進(jìn)針，反復(fù)沖洗骨髓腔，直到股骨變?yōu)樯n白色。輕柔吹打骨髓液，室溫800 rpm離心5 min。PBS沖洗2次，加入2~3 mL培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)瓶中。37℃培養(yǎng)。24 h后全量換液，換液時(shí)用PBS沖洗兩次，去除雜細(xì)胞，約5~7 d細(xì)胞密度達(dá)到80%，可進(jìn)行第一次傳代。其后每次約2~3 d即可傳代。光鏡觀察

6、細(xì)胞形態(tài)變化。
　　2流式細(xì)胞術(shù)鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
　　收集P3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，胰酶消化，1000 rpm離心5 min，用PBS洗滌細(xì)胞3次，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，各管中分別依次加入CD105、CD90、CD44、CD34、CD45抗體，同時(shí)每管樣品設(shè)立同型對(duì)照。避光室溫孵育40 min，PBS清洗細(xì)胞3次，以除去未結(jié)合抗體，加入500μL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。
　　3原代胰腺干細(xì)胞提取培養(yǎng)

7、　　采用膠原酶消化聯(lián)合差速貼壁法，分離培養(yǎng)原代胰腺干細(xì)胞。麻醉處死SD乳鼠，取出胰芽，放入盛有預(yù)冷的PBS的青霉素玻璃瓶中，用PBS輕柔沖洗3次，去除PBS。加入500μL預(yù)熱的0.5 mg/mL膠原酶V，在37℃水浴中輕柔晃動(dòng)10 min，反復(fù)消化，收集上清液，直到組織變?yōu)榧?xì)沙狀。在收集的上清液中加入5%FBS-hanks液，終止消化，輕柔吹打成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液室溫800 rpm離心5 min，沉淀用Hanks液沖洗兩次，反復(fù)離心

8、洗滌3次后，沉淀加入3 mL5%FBS-1640培養(yǎng)基輕柔吹打，移入培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)。提取之后每隔1 h將上層懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入新瓶。收集3、4次差速貼壁后的細(xì)胞，培養(yǎng)。2~3d后細(xì)胞呈現(xiàn)鵝卵石樣，繼續(xù)培養(yǎng)1~2 d，細(xì)胞密度基本達(dá)到80%，即可傳代。光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　4免疫熒光法鑒定胰腺干細(xì)胞
　　將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P2代細(xì)胞接種于預(yù)先放有滅菌玻片的六孔板中，生長(zhǎng)24小時(shí)，融合至80%后將玻片取出，進(jìn)行Nestin和

9、Ngn3的細(xì)胞免疫熒光染色，以檢測(cè)其分布和表達(dá)情況。
　　5胰腺干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)
　　在成功分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和胰腺干細(xì)胞的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)分為：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）組、胰腺干細(xì)胞（PSCS）組、共培養(yǎng)（Co-Culture， CC）組。BMSC組：收集P3代BMSC，以1×106的密度接種于六孔板內(nèi)。PSCS組：收集P2代PSCS，以1×106的密度接種于六孔板內(nèi)。CC組：BMSC以1×106的密度

10、接種于六孔板內(nèi)，PSCS以1×106的密度接種于Transwell小室中，建立BMSC和PSCS的共培養(yǎng)模型。共培養(yǎng)10 d后檢測(cè)胰腺干細(xì)胞標(biāo)志Nestin和Ngn3表達(dá)情況。
　　6 RT-PCR方法檢測(cè)nestin、ngn3的mRNA表達(dá)水平
　　Trizol一步法分別提取各組 Transwell小室下層細(xì)胞中總 RNA，用RT-PCR方法檢測(cè)nestin、ngn3 mRNA表達(dá)。用β-actin做內(nèi)參。
　　7免

11、疫熒光法檢測(cè)Nestin、Ngn3的表達(dá)情況
　　共培養(yǎng)后，免疫熒光法鑒定各組Transwell小室下層細(xì)胞的Nestin、Ngn3蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)變化
　　剛分離提取的細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，呈球形；24 h全量換液時(shí)觀察細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，但大部分細(xì)胞仍為圓形；72 h之后部分細(xì)胞開始出現(xiàn)突起和偽足，形態(tài)呈多角形，并呈現(xiàn)集落式生長(zhǎng)；傳至P3代，形態(tài)大部分為長(zhǎng)梭形、類成纖

12、維樣，并呈漩渦樣生長(zhǎng)。
　　2流式細(xì)胞術(shù)鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，P3代BMSC均表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志分子CD44、CD90、CD105，陽性率分別為89.4%、94.5%、99.8%，而造血細(xì)胞分子標(biāo)志CD34、CD45呈陰性表達(dá)，陽性率分別為9.48%、8.22%。說明提取培養(yǎng)的原代細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　3原代胰腺干細(xì)胞的形態(tài)變化
　　剛分離提取的細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，由于膠原酶 V消

13、化后的細(xì)胞中含有大量的成纖維細(xì)胞，并且成纖維細(xì)胞較胰腺干細(xì)胞易貼壁，因此每隔1h差速貼壁1次；差速2~3次后可見前幾瓶細(xì)胞大量貼壁，并呈長(zhǎng)梭形，乃典型成纖維細(xì)胞。此后的細(xì)胞在24 h后呈現(xiàn)鵝卵石樣，貼壁生長(zhǎng)。
　　4免疫熒光法鑒定胰腺干細(xì)胞
　　免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示， P2代胰腺干細(xì)胞明顯表達(dá)其標(biāo)志分子Nestin、Ngn3蛋白。說明提取培養(yǎng)的原代細(xì)胞為胰腺干細(xì)胞。
　　5共培養(yǎng)后各組nestin、ngn3的mRNA

14、表達(dá)情況
　　與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組比，PSCS組及CC組nestin及ngn3 mRNA水平均顯著升高（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與PSCS組比，CC組nestin mRNA水平顯著降低（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與PSCS組比，CC組ngn3 mRNA水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。說明與 PSCS共培養(yǎng)后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)胰腺干細(xì)胞標(biāo)志基因nestin及ngn3。
　　6共培養(yǎng)后細(xì)胞的Nestin、Ngn3

15、的表達(dá)情況
　　與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組比，PSCS組及CC組Nestin及Ngn3蛋白細(xì)胞分布明顯，且含量均顯著升高（P＜0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與 PSCS組相比，CC組Nestin及Ngn3蛋白分布和含量無明顯差異（P＞0.05）。說明與 PSCS共培養(yǎng)后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中胰腺干細(xì)胞標(biāo)志 Nestin及Ngn3蛋白被誘導(dǎo)合成，向胰腺細(xì)胞方向分化。
　　第二部分：定向誘導(dǎo)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)糖尿病胰島的修復(fù)作用

16、>　　目的：糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一種全球范圍內(nèi)的流行病，因體內(nèi)胰島素相對(duì)或絕對(duì)不足或靶細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低或胰島素本身存在結(jié)構(gòu)上的缺陷而引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的一種慢性疾病，其基本特征為血糖水平升高。目前，糖尿病的治療主要以降血糖類藥物為主，但藥物治療并未取得滿意的治療效果，只是控制血糖的水平，并未從根本上解決胰腺組織胰島功能不足的問題。近年來隨著再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展，干細(xì)胞治療逐步興起，這為

17、解決上述難題提供了新思路。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem,BMSC）是一種在組織工程、再生醫(yī)學(xué)和自身免疫疾病治療方面理想的種子細(xì)胞。然而直接移植BMSC往往由于靶向性不足而使得治療效果不佳。
　　胰腺干細(xì)胞（pancreatic stem cells,PSCS）是一類存在于胎兒和成年胰腺組織中的成體干細(xì)胞，是保持著未達(dá)終末分化狀態(tài)的具有自我更新和多分化潛能的細(xì)胞。但是由于胰腺

18、干細(xì)胞來源十分匱乏，并且存在免疫排斥等問題，直接移植或者誘導(dǎo)其形成類胰島樣細(xì)胞團(tuán)后移植往往達(dá)不到理想的治療效果。
　　本實(shí)驗(yàn)用胰腺干細(xì)胞（PSCS）誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）定向分化后，尾靜脈注射糖尿病大鼠，以探討其對(duì)糖尿病胰島功能的修復(fù)作用。
　　用健康雄性SD大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ）復(fù)制 DM模型，各治療組尾靜脈注射細(xì)胞，測(cè)定血糖、體重變化，測(cè)定糖耐量曲線，利用 DIR-碘

19、化物染色細(xì)胞并示蹤；并取大鼠胰腺于光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，利用 ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清胰島素、C肽含量，利用糖原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)大鼠肝糖原、肌糖原含量，利用Western blot方法檢測(cè)大鼠胰腺組織胰島素蛋白表達(dá)情況，旨在進(jìn)一步探討誘導(dǎo)后細(xì)胞逆轉(zhuǎn)DM的整體功效及作用，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.動(dòng)物分組與取材
　　健康雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為5組，正常組(Con)5只，其余55只腹腔注射STZ

20、溶液制備DM模型。注射3天后，測(cè)空腹血糖高于16.7 mmol/L，為造模成功。造模成功45只，再將其隨機(jī)分成4組：病理組(DM，9只)，PBS組（PBS，5只），BMSC組(BMSC,15只)，共培養(yǎng)組(CC,16只)。以上4組均20-25℃室溫下喂養(yǎng)。BMSC組、共培養(yǎng)組尾靜脈注射各組細(xì)胞5×106個(gè)，每?jī)芍茏⑸?次，共3次。飼養(yǎng)5周后，麻醉處死。
　　2.測(cè)血糖和體重
　　耳緣靜脈取血，用血糖儀檢測(cè)并記錄注射STZ前、

21、后1周、2周、3周、4周、5周的血糖變化。并記錄注射STZ前、后1周、2周、3周、4周、5周的體重變化。
　　3.檢測(cè)糖耐量的變化
　　第2次注射細(xì)胞后第7天上午（覓食結(jié)束），將大鼠禁食6 h。6 h后耳緣靜脈采血，用血糖儀檢測(cè)血糖并記錄，然后腹腔注射葡萄糖（100 mg/mL,注射劑量按1 mg/g體重給予）。分別在注射即刻、0.25 h、0.5 h、1h、2h時(shí)間點(diǎn)測(cè)血糖并記錄，用于描繪糖耐量曲線。
　　4.細(xì)胞標(biāo)

22、記與示蹤
　　DIR-碘化物染色細(xì)胞，尾靜脈注射7天后活體成像儀拍照。
　　5.光鏡下觀察胰腺組織形態(tài)學(xué)變化
　　取胰腺組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片及 HE染色，光鏡下觀察胰腺形態(tài)學(xué)變化。
　　6.胰島素ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清胰島素含量
　　7.C肽ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清C肽含量
　　8.糖原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)大鼠肝糖原、肌糖原含量
　　9.Western blot方法檢測(cè)

23、大鼠胰腺組織胰島素蛋白表達(dá)情況
　　結(jié)果：
　　1.大鼠的一般表現(xiàn)以及血糖和體重變化情況
　　造模成功的大鼠逐漸出現(xiàn)消瘦，皮毛無光澤、疏松，反應(yīng)遲鈍，多飲、多尿、多食、生長(zhǎng)遲緩等癥狀。隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，DM組和 PBS組體征更加明顯，而BMSC組及CC組明顯有好轉(zhuǎn)。
　　各組大鼠入選時(shí)血糖和體重?zé)o顯著性差異。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，BMSC組及CC組平均體重均無顯著性差異(P>0.05)，以上兩組均顯著高于DM組及PBS組(P<

24、0.01)。
　　BMSC組及CC組平均體血糖均無顯著性差異(P>0.05)，以上兩組均顯著低于DM組及PBS組(P<0.01)（Fig.1）。
　　2.大鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)
　　與DM組、PBS組相比，BMSC組及CC組糖耐量曲線變化明顯較優(yōu)（P<0.01）(見Fig.2)。
　　3.細(xì)胞標(biāo)記與示蹤
　　活體成像結(jié)果顯示，移植后的細(xì)胞可在體內(nèi)腹部集中。
　　4.光鏡下觀察胰腺組織形態(tài)學(xué)變化
　　Co

25、n組：胰島數(shù)目較多，輪廓規(guī)則整齊，胰島體積大，胰島內(nèi)細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核居中，胞漿均勻，細(xì)胞界限清楚
　　DM組及 PBS組：胰島數(shù)目中度至重度減少，胰島體積中度至重度減小，細(xì)胞空泡變性，細(xì)胞核偏向一側(cè)，可見調(diào)亡。
　　BMSC組：胰島數(shù)目中度減少，胰島體積中度減小，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)減少，可見空泡變性。
　　CC組：胰島數(shù)目較多，胰島體積輕度減小，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)輕度減少，偶見空泡變性,胞漿較均勻。
　　5.ELSIA檢

26、測(cè)各組大鼠血清中胰島素、C肽含量的變化
　　與Con組比，DM組、PBS組、BMSC組、CC組胰島素及C肽水平顯著降低(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與BMSC組比CC組胰島素水平明顯升高(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6.糖原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)大鼠肝糖原、肌糖原含量的變化
　　與Con組比，DM組、PBS組、BMSC組、CC組肝糖原及肌糖原水平顯著降低（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與BMSC組比CC組肝糖原

27、水平明顯升高（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而與BMSC組比CC組肌糖原水平并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　7.Western Blot法檢測(cè)大鼠胰島素含量的變化
　　與Con組比，DM組及PBS組胰島素水平顯著降低（P<0.05），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而與Con組比CC組胰島素水平并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.與胰腺干細(xì)胞共培養(yǎng)，可成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為胰腺干細(xì)胞樣細(xì)胞。