補腎中藥單體巴戟甲素、女貞苷、淫羊藿苷對AD模型的保護作用及機制探討.pdf

1、目的:
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種原發(fā)性神經(jīng)退行性病變，其病理學(xué)特征為淀粉樣蛋白(Amyliod-protein, Aβ)沉積形成老年斑(senile plaques，SPs)、神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NETs)以及特有的中樞膽堿能神經(jīng)元的大量死亡及丟失等[1-2]。大腦內(nèi)的Aβ的產(chǎn)生和降解機制失衡是現(xiàn)在比較公認(rèn)的阿爾茨海默癥的發(fā)病機制。<

2、br>　　中藥復(fù)方的研究雖然有多靶點的治療優(yōu)勢，但不能清楚說明參與疾病機制調(diào)控的作用靶點，而中藥單體研究的優(yōu)勢則更加突顯。
　　中醫(yī)學(xué)認(rèn)為阿爾茨海默病最主要的發(fā)病機制與腎虛有關(guān)。因此，本實驗選取臨床常用的補腎要藥的有效單體成分——巴戟甲素（巴戟天提取物），女貞苷（女貞子提取物），淫羊藿苷（淫羊藿提取物）進行篩選，并探討對AD模型的有保護作用的補腎單體的可能作用機制。
　　方法
　　1.篩選淀粉樣蛋白Aβ42對入神經(jīng)母細

3、胞瘤細胞SH-SY5Y細胞最佳的損傷濃度，然后建立穩(wěn)定的細胞損傷模型。
　　2.分別在小鼠腦內(nèi)皮細胞(EC)和SH-SY5Y細胞上篩選出補腎中藥單體巴戟甲素、女貞苷、淫羊藿苷合適的作用濃度，并進行后續(xù)實驗。
　　3.通過MTT法檢測細胞活力及顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，從以上三種中藥單體中篩選出對Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞神經(jīng)毒性有保護作用的單體。
　　4.選擇有效的補腎中藥單體，對其保護機制進行探討。
　　

4、4.1、巴戟甲素對AD模型保護作用的機制探討
　　4.1.1、巴戟甲素對Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞保護作用的機制探討:巴戟甲素作用于細胞12h，免疫印跡法檢測其對細胞低密度脂蛋白受體1(LRP1)，淀粉樣前體蛋白(APP)的影響，實時熒光定量PCR檢測SH-SY5Y細胞LRP1mRNA表達的變化。巴戟甲素分別作用于正常的SH-SY5Y細胞和SiLRP1SH-SY5Y細胞后，加入Aβ42，用Elisa法分別檢測胞內(nèi)胞外的Aβ4

5、2變化水平，激光共聚焦觀察隨時間變化Aβ42進入細胞及與溶酶體共定位的情況。
　　4.1.2、巴戟甲素對APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的影響:選擇7月齡的SPF級雄性APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠58只(品系名稱:B6C3-Tg(APPswe，PSEN1dE9)85Dbo/J(簡稱:APPSWe/PS1dE9)，相同背景的非轉(zhuǎn)基因小鼠C57BL/6J。雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為模型組、巴戟甲素低劑量(20mg/kg)

6、組、巴戟甲素高劑量（80mg/kg）組，每組10只;同背景非轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠作為野生對照組，每組10只;灌胃處理1個月。給藥結(jié)束后取小鼠海馬組織，用Western blot檢測其LRP1的表達。
　　4.2、女貞苷對Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞保護作用的機制探討:女貞苷作用SH-SY5Y細胞后加入Aβ42，用Elisa法檢測胞外的Aβ42含量，免疫印跡法檢測NF-KB，Bcl-2，LC3蛋白變化。
　　實驗結(jié)果

7、:
　　1.使用不同濃度的Aβ42（5μmol·L-1、10μmol·L-1、15μmol·L-1、20μmol·L-1、40μmol·L-1）損傷SH-SY5Y細胞，各組細胞活力均降低，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但5μmol·L-1、10μmol·L-1損傷SH-SY5Y細胞的作用不夠強，15μmol·L-1、20μmol·L-1、40μmol·L-1均可以損傷的條件下，則選擇最小劑量的15μmol·L-1 Aβ42作為最

8、佳濃度進行后續(xù)的實驗。
　　2.在入神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y上篩選巴戟甲素、女貞苷、淫羊藿苷合適的用藥濃度，結(jié)果表明巴戟甲素、女貞苷、淫羊藿苷濃度達到500μmol·L-1時，對細胞活力無明顯影響(P＞0.05)。將巴戟甲素、女貞苷再次作用于更為敏感小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞進行篩選，實驗結(jié)果表明巴戟甲素、女貞苷濃度小于500μmol·L-1時，對內(nèi)皮細胞活力亦無明顯影響(P＞0.05)。
　　3.淫羊藿苷濃度為5、50、5

9、00μmol·L-1時，對Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞神經(jīng)毒性的對細胞活力無明顯影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明淫羊藿苷對該AD模型沒有明顯的保護作用，后續(xù)的機制探討實驗不予選取。
　　4.巴戟甲素對Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞的保護作用及機制探討
　　4.1、巴戟甲素的濃度為50、100、500μmol·L-1時，對Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷均有保護作用(P＜0.05)。
　　4.2、巴

10、戟甲素保護作用初步的機制探討
　　4.2.1、巴戟甲素作用于SH-SY5Y細胞12h后，與正常組比較，巴戟甲素組(50、100μmol·L-1)細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白LRP1的蛋白表達明顯增加(P＜0.05)，淀粉前體樣蛋白(APP)表達無明顯變化(P＞0.05)。Elisa檢測細胞胞內(nèi)及條件培養(yǎng)基中Aβ42的含量，結(jié)果顯示巴戟甲素可以有效增加SH-SY5Y細胞對Aβ42的清除作用，與模型組條件培養(yǎng)基Aβ42含量比較，巴戟甲素(50、10

11、0μmol·L-1)組條件培養(yǎng)基的Aβ42含量相對減少(P＜0.05);與模型組胞內(nèi)Aβ42含量比較，巴戟甲素組(50μmol·L-1)胞內(nèi)的Aβ42含量相對增加(P＜0.05)，巴戟甲素組（100μmol·L-1）胞內(nèi)的Aβ42含量差異不明顯(P＞0.05)。激光共聚焦的結(jié)果顯示根據(jù)時間點的不同，在30min時與對照組相比，巴戟甲素組中的Aβ42進入SH-SY5Y細胞的較多。隨時間增加，在60min時，巴戟甲素組內(nèi)吞Aβ42多于模型組

12、，但此時Aβ42與溶酶體的無共定位。在120min時，對照組開始出現(xiàn)少量的Aβ42與溶酶體的共定位;與之相比，巴戟甲素組的細胞內(nèi)出現(xiàn)的Aβ42與溶酶體的共定位要更多。
　　4.2.2、基因干擾LRP1進行反向論證:巴戟甲素同時作用在正常的SH-SY5Y細胞和SiLRP1的SH-SY5Y細胞上，Elisa檢測模型組、巴戟甲素組胞內(nèi)及條件培養(yǎng)基Aβ42的含量。結(jié)果顯示與模型組條件培養(yǎng)基比較，巴戟甲素組的條件培養(yǎng)基Aβ42的含量無明顯差

13、異(P＞0.05);與正常SH-SY5Y細胞模型組Aβ42的含量相比，SiLRP1的SH-SY5Y細胞胞外Aβ42含量明顯增高(P＜0.05);與正常SH-SY5Y細胞巴戟甲素組比較，Si LRP1細胞的巴戟甲素組胞外Aβ42的含量也明顯增加(P＜0.05)?；虺聊M中的巴戟甲素的兩個用藥組和模型組相比，雖有降低的趨勢，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.2.3、轉(zhuǎn)基因小鼠灌胃1月，取其海馬區(qū)的組織用Western

14、blot法檢測其LRP1蛋白表達，發(fā)現(xiàn)巴戟甲素組的LRP1表達與正常組和模型組的蛋白表達并未見明顯差異(P＞0.05)。
　　5.女貞苷對Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞的保護作用及機制探討
　　5.1、女貞苷的濃度為50、100μmol·L-1時，對Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞神經(jīng)毒性的均有保護作用，可明顯增加細胞存活率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。顯微鏡下觀察Aβ42模型組與正常對照組細胞比較，正常對照組細胞生

15、長良好，樹枝狀軸突明顯，細胞透亮;模型組細胞形態(tài)邊緣模糊，細胞皺縮，軸突消失;與模型組比較，女貞苷兩個用藥組細胞凋亡明顯減少。
　　5.2、初步機制探討:女貞苷作用SH-SY5Y細胞后，Western blot檢測自噬小體標(biāo)記物L(fēng)C3，結(jié)果表明模型組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相對表達量與正常組相比明顯增加（P＜0.05），與模型組相較，女貞苷組(50、100μmol·L-1）的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯減少(P＜0.05);NF-κB蛋白

16、表達與模型組比較，檢測女貞苷組（50、100μmol·L-1）的明顯減少(P＜0.05)，抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表達則明顯增加(P＜0.05)。女貞苷同時也能增加SH-SY5Y細胞對Aβ42的清除，Elisa檢測結(jié)果顯示，與模型組條件培養(yǎng)基的Aβ42含量比較，女貞苷組（50、100μmol·L-1）的Aβ42含量均下降。
　　結(jié)論:
　　1.淫羊藿苷對Aβ42誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞神經(jīng)毒性損傷沒有明顯保護作用。
　

17、　2.巴戟甲素可以保護Aα42誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞神經(jīng)毒性損傷，其可能機制是巴戟甲素作用于SH-SY5Y細胞可有效增加入神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白LRP1的表達，增加細胞對Aβ42的轉(zhuǎn)運內(nèi)吞以及溶酶體對其清除，減少Aβ42在胞外的沉積從而降低Aβ42產(chǎn)生的細胞毒性，起到保護神經(jīng)元的作用。在轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的海馬區(qū)卻未見LRP1蛋白表達明顯增加可能由于選擇的動物模型與細胞模型作用機制不一致引起的。
　　3.女貞苷可