中藥單體對肝細胞的保護作用及其線粒體機制研究.pdf

1、肝細胞是肝內(nèi)數(shù)量最多，體積最大的細胞群，約占肝臟細胞總量的80％。當(dāng)肝細胞損傷時，會釋放出一系列的細胞因子，激活肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)，促使細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)異常增生，導(dǎo)致肝纖維化（Hepatic fibrosis）形成。肝細胞損傷在肝纖維化發(fā)生過程中起著非常重要的作用，尤其是肝細胞凋亡。尋找肝細胞保護藥物將成為肝纖維化治療的關(guān)鍵靶點。線粒體是細胞內(nèi)活

2、性氧(Reactive oxygen species，ROS)主要來源地，也是ROS氧化損傷的。因此尋找天然抗氧化物如中藥或中藥單體，清除細胞內(nèi)過量的ROS，維持線粒體正常功能形態(tài)來保護肝細胞，是開啟肝纖維化藥物治療的新途徑。
　　冬蟲夏草又名蟲草(Cordyceps sinensis)是一種名貴的藥用真菌，具有抗炎癥，抗癌癥，抗衰老，增強免疫功能和調(diào)節(jié)生死等功能。越來越多研究表明在各種氧化應(yīng)激引起的細胞損傷過程中，蟲草起到一定的

3、抗氧化作用，保護線粒體。由于蟲草包含很多有效成分如蟲草多糖，蟲草素，蟲草酸，生物堿，脂肪和脂肪酸等，具體哪種有效成分起抗氧化作用還尚不清楚。本研究主要從蟲草中選取蟲草多糖(Cordyceps polysaccharide，CPS)，蟲草素和蟲草酸三種有效成分，研究它們對線粒體的保護作用。細胞活性實驗篩選出最佳藥物濃度，hoechst33258熒光染色檢測細胞凋亡，同時檢測了線粒體ROS，線粒體膜電位(mitochondrialmembr

4、ane potential，MMP)，能量(Adenosine Triphosphate，ATP)合成，細胞色素C(Cytochrome C，Cyto C)釋放，免疫跡印實驗檢測Bax和Bcl-2蛋白表達。實驗結(jié)果顯示CPS抑制過氧化氫誘導(dǎo)地肝細胞活性下降，抑制肝細胞凋亡，并且消除細胞內(nèi)多余的ROS，維持MMP穩(wěn)定，保證ATP正常合成，阻止Cyto C釋放，并且下降Bax/Bcl-2比率，這些研究都表明蟲草多糖發(fā)揮抗氧化活性保護線粒體不

5、受損傷。蟲草素不能阻止過氧化氫誘導(dǎo)地肝細胞活力下降，和蟲草酸可以抑制細胞活力下降，蟲草素和蟲草酸對線粒體各項指標(biāo)的保護作用都不是很顯著。
　　丹參(Salvia miltiorrhiza)是一種藥用價值非常高的傳統(tǒng)中藥(TraditionalChinese Medicine, TCM)，被廣泛地用于治療各種疾病如腦血管疾病、心血管疾病、心衰、肝硬化、肝纖維化等。大量研究表明丹參、丹參復(fù)方制劑及丹參有效成分在慢性肝病尤其是肝纖維化治

6、療起著非常重要，主要作用機制是丹參具有抗氧化活力，消除自由基，保護生物膜。以前研究發(fā)現(xiàn)丹參藥理成分包括脂溶性成分和水溶性成分，丹參水溶性成分藥理活性最顯著，尤其是以丹參素為基本結(jié)構(gòu)的酚酸類化合物抗氧化活性最強。本實驗主要對丹參酚酸類化合物丹酚酸B(Salvia miltiorrhiza B,SalB)、原兒茶醛和丹參素鈉進行線粒體保護研究。本部分采用的實驗方法與蟲草有效成分對線粒體保護作用研究相同。實驗結(jié)果顯示SalB抵制過氧化氫誘導(dǎo)地

7、細胞活性下降，阻止細胞凋亡，消除細胞內(nèi)多余的ROS，阻止MMP崩解，維持ATP正常合成，阻止Cyto C釋放，降低Bax/Bcl-2比值，抑制pro-caspase3的活化成cleave-caspase3，這些研究表明SalB發(fā)揮抗氧化作用，抑制過氧化氫誘導(dǎo)地線粒體凋亡，從而保護肝細胞。原兒茶醛和丹參素鈉不能抑制細胞活力下降，但能消除細胞內(nèi)多余ROS，對線粒體其他指標(biāo)保護作用不能明顯。
　　在正常細胞內(nèi)，線粒體相互連接形成管網(wǎng)狀結(jié)

8、構(gòu)，并發(fā)生著頻繁地融合與分裂。線粒體融合與分裂是由一系列蛋白介導(dǎo)的，二者之間的動態(tài)平衡維持著線粒體的形態(tài)和功能。當(dāng)細胞受氧化應(yīng)激刺激后，融合與分裂失衡，線粒體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)碎裂，形成點泡狀。Mortalin是HSP70家庭成員之一，主要定位于線粒體，參與應(yīng)激反應(yīng)、胞內(nèi)運輸、線粒體蛋白輸入、調(diào)控細胞增殖和分化、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動。我們實驗室以前研究發(fā)現(xiàn)mortalin高表達能夠清除細胞內(nèi)多余的ROS，維持線粒體膜電位穩(wěn)定和ATP正常合成，

9、阻止Cyto C釋放，抑制Bax構(gòu)象改變，抑制缺糖誘導(dǎo)地PC12細胞凋亡。第二部分實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)SalB具有抗氧化作用，保護線粒體正常功能。但是mortalin和SalB是否通過維持線粒體融合與分裂之間地平衡來保護線粒體以及mortalin和SalB是否存在某種聯(lián)系，這些機制都尚不清楚。本實驗采用MTG標(biāo)記線粒體，構(gòu)建mortalin高表達與低表達質(zhì)料，實時定量PCR檢測線粒體融合分裂相關(guān)因子mRNA表達水平，免疫印跡檢測了線粒體融合分裂

10、相關(guān)因子蛋白表達水平。實驗結(jié)果顯示SalB和mortalin高表達抑制過氧化氫誘導(dǎo)地線粒體片段化，mortalin低表達不影響線粒體形態(tài)，過氧化氫處理后加劇線粒體片段化，SalB能夠增加mortalin蛋白表達量。Mortalin高表達能夠提高Mfnl和Opa1 mRNA表達水平，對Mfn2 mRNA表達水平?jīng)]有影響，降低Hfis1和MTP18 mRNA表達水平，提高Drp1 mRNA表達水平。SalB對Mfn2沒有直接作用，提高Hfi