補腎中藥單體對mESC自我更新和分化的影響及機制研究.pdf

1、課題組研究發(fā)現(xiàn)，腎精具有干細胞的內(nèi)涵。本項目選取臨床常用的四種代表性補腎藥物淫羊藿、補骨脂、女貞子、何首烏的有效單體為研究對象，以柴胡的有效單體為非補腎藥物對照，并以文獻報道的誘導(dǎo)分化藥維甲酸(RA)為陽性對照，觀察其對小鼠胚胎干細胞(mESC)自我更新及不同胚層的分化的影響，并進行初步的分子機制探索。本項目從藥物效應(yīng)角度為“腎藏精與干細胞的關(guān)系”的命題提供部分實驗依據(jù)。
　　目的:
　　1觀察補腎中藥單體淫羊藿苷(ICA)

2、、補骨脂素(Pso)、齊墩果酸(OA)、二苯乙烯苷(THSG)對mESC自我更新和分化的影響。
　　2探索上述中藥單體對mESC作用的分子機制。
　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng)、分組及藥物干預(yù):取對數(shù)期的mESC懸滴3天形成擬胚體后再懸浮培養(yǎng)2天，在第6天貼壁時加入中藥單體進行干預(yù)。實驗分為正常對照組、溶劑對照組(DMSO)、分化陽性對照組(RA)、補腎中藥單體組(ICA、THSG、Pso、OA)及非補腎中藥單體組（柴胡

3、皂苷Sai），每組均設(shè)高、中、低3個濃度梯度。
　　2.Alamar染色檢測藥物對mESC生長曲線和早期增殖的影響:取對數(shù)期mESC接種于96孔板，加入不同濃度的中藥單體，Alamar檢測不同時點的OD值。
　　3.堿性磷酸酶(AP)染色檢測補腎中藥單體對mESC克隆效率的影響:取對數(shù)期mESC接種于96孔板，加入不同濃度的中藥單體，AP染色，并在顯微鏡下分類計數(shù)。計數(shù)標準為每個克隆藍紫色染色面積大于該克隆總面積的90％為未

4、分化克隆，小于總面積20％為分化克隆，其余為混合型克隆。
　　4.干性維持基因及不同胚層標志物的檢測:采用RT-PCR、qPCR及蛋白印跡檢測mESC干性維持基因Oct3/4、Nanog、 Sox2，內(nèi)胚層標志物Sox17，中胚層Brachyury、 Nkx2.5和外胚層標志物Pax6。
　　5.mESC調(diào)控相關(guān)LIF通路關(guān)鍵分子的檢測:采用RT-PCR、蛋白印跡檢測LIF信號通路的主要分子ERK1、C-fos、p38MAP

5、K、C-jun、gp130、Stat3、JAK1、ERK5的水平。
　　結(jié)果:
　　我們首先觀察到分化陽性對照藥RA能顯著抑制mESC早期增殖，降低未分化克隆數(shù)目并顯著降低mESC干性轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Nanog、Sox2表達，升高胚層分化標志物Brachyury、Pax6的表達，結(jié)果與文獻報道一致，表明本實驗系統(tǒng)穩(wěn)定可靠。
　　1.補腎藥有效成份ICA、THSG、Pso及OA對mESC自我更新及胚層分化的影響:<

6、br>　　1) ICA能顯著促進mESC克隆分化;顯著降低Oct3/4表達，升高Sox17、Brachyury及Nkx2.5表達。
　　2) THSG能顯著促進mESC克隆分化;顯著降低Oct3/4表達，升高Sox17、Brachyury表達。
　　3) Pso能顯著促進mESC克隆自我更新;顯著升高Oct3/4、Nanog、Sox2表達，降低Brachyury表達。
　　4) OA對mESC克隆數(shù)目及形態(tài)無顯著影響，

7、能降低Oct3/4 mRNA表達，但對Oct3/4蛋白表達無顯著影響;OA對各胚層標志物表達均無顯著影響。
　　5)疏肝理氣藥主要成份Sai能促進Pax6表達，但對mESC克隆數(shù)目及形態(tài)無顯著影響。
　　2.ICA、THSG、Pso對mESC調(diào)控相關(guān)LIF通路關(guān)鍵分子的影響
　　ICA顯著降低LIF上游分子JAK1、gp130表達，降低LIF下游轉(zhuǎn)錄因子stat3即其磷酸化水平;THSG顯著降低LIF上游分子JAK1表

8、達，降低下游分子gp130及轉(zhuǎn)錄因子stat3蛋白及其磷酸化水平;Pso顯著升高LIF下游stat3蛋白磷酸化水平。
　　結(jié)論
　　綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)補腎藥主要成分ICA及THSG可能通過抑制gp130/stat3信號通路以促進mESC早期向內(nèi)、中胚層分化;Pso則可能通過促進stat3蛋白磷酸化以維持mESC干性。
　　本研究為“腎藏精具有干細胞內(nèi)涵”提供科學(xué)依據(jù)，并提示補腎藥物對于細胞具有不同的效應(yīng)和通路，為臨