天花粉蛋白對結(jié)腸癌SW-620細(xì)胞株增殖、黏附和遷移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[研究背景]
　　 結(jié)腸癌目前是我國繼肺癌、胃癌、肝癌后第4位常見的腫瘤。隨著生活水平的提升、飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率明顯升高，目前手術(shù)切除仍是主要的治療方案，但仍有相當(dāng)多的患者在手術(shù)時發(fā)現(xiàn)已通過血行轉(zhuǎn)移至肝、肺等。
　　 腫瘤在本質(zhì)上是基因病。其發(fā)病由多方面因素決定，外源性因素包括物理、化學(xué)、生物等，內(nèi)源性因素包括遺傳、免疫、精神等。各種內(nèi)外源性的因素以協(xié)同或序貫的方式引起細(xì)胞癌變，從而激活原癌基因和(或)滅活腫

2、瘤抑制基因，加上凋亡調(diào)節(jié)基因和(或)DNA修復(fù)基因的改變，繼而引起蛋白表達(dá)水平的異常，其中活性氧自由基(ORS)在腫瘤的發(fā)生過程中起到推波促瀾的作用。腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡調(diào)控的失調(diào)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無限增殖，其與組織基質(zhì)黏附的改變及其自身生物學(xué)特性導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。目前的常用抗腫瘤藥的主要機(jī)理也在于此。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生的病因不外內(nèi)傷和外傷病因，內(nèi)傷病因涉及到人體正氣的虛弱及情志因素的變化，外傷因素涉及到飲食、環(huán)境、地域、蟲毒及致

3、病邪氣等。目前，中醫(yī)對腫瘤的病機(jī)主要概括為氣滯血瘀、痰濕凝聚、熱毒內(nèi)蘊(yùn)、臟腑失調(diào)、正氣虛弱，法隨證立，臨床上中醫(yī)對腫瘤的治療大法也主要是活血化瘀、化痰祛濕、清熱解毒、扶正固本等，常用的中藥有活血化瘀藥、祛痰化濕藥、清熱解毒藥、補(bǔ)虛藥。這些中藥中有很多藥物都有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，比如紫三醇、三氧化二砷等。
　　 天花粉(TrichosanthesKirilowiiMaxim)為葫蘆科植物栝樓的根，是臨床上常用

4、的中藥，具有清熱瀉火，生津止渴，排膿消腫等作用。天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是從天花粉中提取的一種Ⅰ型核糖體滅活蛋白(ribosome-inactivatingprotein，RIPs)，由247個氨基酸殘基組成，分子量約為27610,具有N-糖苷酶活性。天花粉蛋白臨床用于引產(chǎn)及異位妊娠已有多年的經(jīng)驗(yàn)，但最近的一些藥理研究發(fā)現(xiàn)其還有多種其他的藥理活性，如抗HIV，抗腫瘤等作用，而其抗腫瘤作用是當(dāng)前研究的重點(diǎn)，但主要集

5、中在官頸癌、絨毛膜癌等腫瘤，而腸癌研究方面報道較少，本實(shí)驗(yàn)選擇具有高度轉(zhuǎn)移性的人結(jié)腸癌SW-620細(xì)胞株，通過體外試驗(yàn)來觀察TCS對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW-620細(xì)胞株的增殖、黏附和遷移作用，并初步探討其機(jī)制。
　　 [研究目的]
　　 為研究天花粉蛋白(TCS)對結(jié)腸癌SW-620細(xì)胞株增殖、黏附和遷移的影響，以具有高度轉(zhuǎn)移性的人結(jié)腸癌SW-620細(xì)胞株為研究對象，觀察天花粉蛋白對SW-620細(xì)胞株的生長增殖及凋亡的影響，

6、并探討天花粉蛋白對SW-620細(xì)胞株遷移及與其人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)黏附作用的影響。
　　 [研究方法]
　　 1.采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測TCS對SW-620細(xì)胞增殖抑制作用。
　　 2.Hoechst33258熒光染色法觀察TCS誘導(dǎo)SW-620細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化。
　　 3.AnnexinV-PI雙染法檢測TCS對SW-620細(xì)胞的早期凋亡作用，PI單染法檢測TCS對SW-620細(xì)

7、胞周期的影響。
　　 4.劃痕實(shí)驗(yàn)觀察TCS對SW-620細(xì)胞遷移作用。
　　 5.血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附試驗(yàn)檢測TCS對SW-620細(xì)胞與HUVEC細(xì)胞黏附作用影響。
　　 [研究結(jié)果]
　　 1.TCS對SW620和細(xì)胞的生長抑制作用：MTT結(jié)果表明，與對照組相比，TCS對SW620生長抑制作用明顯，且呈時間和劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)組分別經(jīng)0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μg/mlTCS處理24

8、、48、72h后，SW620細(xì)胞生存率均隨著TCS濃度的提高逐漸下降，生長均不同程度地受到抑制，且呈時間和濃度依賴性，24、48、72h的IC50為56.8、33.96、22.18μg/ml，除0.625μg/ml在24h與對照組無相比差異外，其他濃度組都有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　 2.Hoeehst33258熒光染色法觀察經(jīng)過TCS處理后的SW-620細(xì)胞的形態(tài)變化
　　 經(jīng)過20、40μg/mlTCS作用4

9、8h后，可在熒光顯微鏡下看見凋亡的細(xì)胞，凋亡的細(xì)胞核體積縮小，核染色質(zhì)聚集，有碎片樣凋亡小體的出現(xiàn)，而對照組則未見到此現(xiàn)象。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)顯示：SW-620對照組早期凋亡率為(0.77±0.75)％，而經(jīng)過20、40μg/mlTCS處理細(xì)胞48h后，細(xì)胞的早期凋亡率分別是(3.53±1.07)％、(6.7±0.5)％，結(jié)果與對照組相比，20μg/ml的TCS無明顯誘導(dǎo)SW-620細(xì)胞的早期凋亡作用(P>0.05)，而40

10、μg/ml的TCS則具有誘導(dǎo)SW-620調(diào)亡的作用(P<0.05)。
　　 對照組S期的比例分別為25.15％，G1期比例分別為64.56％，經(jīng)過20、40μg/mlTCS作用48h后，S期比例分別升高到32.19％、58.09％，G1期分別比例下降為59.21％、33.91％，G2/M期無顯著變化。結(jié)果提示，TCS能將SW-620細(xì)胞阻滯在S期，作用呈濃度依賴性。
　　 4.血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附試驗(yàn)：血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附實(shí)

11、驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的TCS處理48h后的SW-620細(xì)胞與HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)2h后，與對照組相比，細(xì)胞黏附率均下降，其中20μg/ml和40μg/ml與對照組相比，P值分別為P=0.03和P=0.01，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 5.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測TCS對SW-620的遷移的影響：24、48h陰性對照組遷移距離為(154.8±18.3)、(222.0±12.2)像素，經(jīng)2.5μg/mlTCS共同培養(yǎng)24、48h后，其遷移距離分別

12、為(58.40±15.7)、(97.0±16.4)像素，與對照組相比，2.5μg/mlTCS能抑制SW620的遷移(P<0.01)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.不同濃度天花粉蛋白能夠抑制SW-620細(xì)胞增殖，抑制作用呈的劑量時間效應(yīng)關(guān)系。
　　 2.Hoechst33258熒光染色法顯示天花粉蛋白能夠誘導(dǎo)SW-620細(xì)胞凋亡，呈特征性的細(xì)胞凋亡形態(tài)；
　　 3.天花粉蛋白能促進(jìn)SW-620細(xì)胞的早期凋亡，