轉(zhuǎn)錄因子RBP-J通過(guò)介導(dǎo)Notch信號(hào)調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞分化.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育是脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中調(diào)控最復(fù)雜、次序最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)氖录弧Ｅ咛ド窠?jīng)管中的神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcells，NSCs）是一種維持自我更新的多潛能細(xì)胞，可以進(jìn)一步分化為各種不同類(lèi)型的神經(jīng)細(xì)胞。在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，NSCs隨著發(fā)育階段的不同變換著它們的響應(yīng)性和發(fā)育潛能。在早期擴(kuò)增階段，神經(jīng)干細(xì)胞主要進(jìn)行廣泛的增殖來(lái)擴(kuò)大細(xì)胞群體。隨著發(fā)育的進(jìn)行，一些神經(jīng)干細(xì)胞在區(qū)域性神經(jīng)誘導(dǎo)信號(hào)的作用下起始了原神經(jīng)基因（proneura

2、lgene）的表達(dá)。Proneuralgenes是一類(lèi)堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basichelix-loop-helix,bHLH）轉(zhuǎn)錄因子，如Mash1、Ngn1/2和Math1等，它們可以誘導(dǎo)神經(jīng)元特異性基因的表達(dá)，從而將多潛能的神經(jīng)干細(xì)胞決定到神經(jīng)元分化命運(yùn)上來(lái)。隨著proneural基因的表達(dá)，神經(jīng)管中原本相對(duì)均一的NSCs群體開(kāi)始形成差異。那些起始表達(dá)proneural基因的NSCs分化為神經(jīng)元前體細(xì)胞，而未表達(dá)proneura

3、l基因的細(xì)胞仍然維持干細(xì)胞狀態(tài)。隨后，神經(jīng)元前體細(xì)胞開(kāi)始退出細(xì)胞周期，遷移至神經(jīng)管外側(cè)并分化為神經(jīng)元。而NSCs仍然維持未分化狀態(tài)直到神經(jīng)發(fā)生晚期，再在特定神經(jīng)誘導(dǎo)信號(hào)的作用下分化為晚期的神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型，比如膠質(zhì)細(xì)胞。維持一個(gè)適當(dāng)規(guī)模的NSCs群體對(duì)于神經(jīng)發(fā)育的正常進(jìn)行至關(guān)重要，如果NSCs提前分化則會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷。由于NSCs沒(méi)有得到充分的擴(kuò)增，會(huì)最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞總量的下降。同時(shí)，NSCs提前分化只產(chǎn)生早期的神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型，

4、從而導(dǎo)致晚期神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型的缺失，因而不能建立正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。除此以外，由于NSCs強(qiáng)大的分化潛能和自我更新能力，在醫(yī)學(xué)上還具有治療神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性變等疾病的潛能。
　　視網(wǎng)膜是研究神經(jīng)干細(xì)胞/神經(jīng)前體細(xì)胞（Neuralprogenitorcells,NPCs）增殖分化的優(yōu)異模型。在神經(jīng)發(fā)育早期，視網(wǎng)膜由間腦的神經(jīng)上皮向兩側(cè)形成突起發(fā)育而來(lái)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)地一部分。在哺乳類(lèi)神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，視網(wǎng)膜前體細(xì)胞（Retinalpro

5、genitorcells,RPCs）可以分化形成視網(wǎng)膜中的7種主要神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型，這些不同的細(xì)胞類(lèi)型在視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮增殖的同時(shí)依次分化出現(xiàn)：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、視錐細(xì)胞及水平細(xì)胞最先生成，接著是無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞和視桿細(xì)胞，最后才是雙極細(xì)胞和Müller氏膠質(zhì)細(xì)胞。分化中的神經(jīng)細(xì)胞要遷移到適當(dāng)?shù)奈恢?，以形成正確的細(xì)胞排列，并最終形成視網(wǎng)膜的五個(gè)組織層次，包括三個(gè)有核層(nuclearlayers)及將它們聯(lián)系在一起的兩個(gè)突觸層(synapticlayer

6、s)，從而完成光信號(hào)的接受、轉(zhuǎn)換和傳導(dǎo)。視網(wǎng)膜豐富的細(xì)胞類(lèi)型和規(guī)則的層次結(jié)構(gòu)，是視覺(jué)功能實(shí)現(xiàn)的生物基礎(chǔ)。
　　與視網(wǎng)膜相同，小腦(cerebellem)特別是小腦皮層是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為高度有序的結(jié)構(gòu)之一。與大腦皮層相比，它的特征性和簡(jiǎn)單性使其成為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育機(jī)制的又一經(jīng)典模型。發(fā)育中過(guò)程中，由小腦室區(qū)和菱腦唇兩個(gè)生發(fā)中心分化出九型神經(jīng)細(xì)胞：包括浦肯野(氏)細(xì)胞、高爾基細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、籃狀細(xì)胞、星形細(xì)胞和Lugaro細(xì)胞，單

7、極刷(形)細(xì)胞，和燭臺(tái)（狀）細(xì)胞，以及小腦特異性的Bergmann(氏)膠質(zhì)細(xì)胞。成熟的小腦皮層由這八型神經(jīng)元和一型膠質(zhì)細(xì)胞排列成精確的立體結(jié)構(gòu)，并形成復(fù)雜的神經(jīng)環(huán)路從而實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)、技能學(xué)習(xí)等重要的生理功能。
　　在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，NSC/NPCs的增殖和分化受到多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的精確調(diào)控。以細(xì)胞膜受體Notch、轉(zhuǎn)錄因子RBP-J及其下游效應(yīng)基因組成的Notch信號(hào)途徑是調(diào)控發(fā)育過(guò)程的基本信號(hào)之一。雖然既往研究揭示出Notch

8、途徑在神經(jīng)細(xì)胞分化中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但操作Notch途徑不同分子得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有差別，其發(fā)揮作用的下游靶點(diǎn)也存在爭(zhēng)議?；诟深A(yù)單個(gè)Notch受體或其下游基因的研究方法，不足以反映Notch信號(hào)功能的全貌。由于在哺乳動(dòng)物中，Rbpj編碼的轉(zhuǎn)錄因子可以整合并傳遞來(lái)源于四型Notch受體的信號(hào)，從而激活下游基因轉(zhuǎn)錄。因此在本課題研究中，我們利用Cre-Loxp重組酶系統(tǒng)，在小鼠RPCs和小腦原基的NPCs中特異性剔除Rbpj基因。

9、>　　Rbpj敲除視網(wǎng)膜與野生型小鼠視網(wǎng)膜相比，出現(xiàn)明顯的發(fā)育障礙和視網(wǎng)膜層次結(jié)構(gòu)異常。視網(wǎng)膜發(fā)育早期，RPCs分化加速，表現(xiàn)為一系列proneural基因表達(dá)上調(diào)。然而，僅有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和感光細(xì)胞增多，中間神經(jīng)元數(shù)目減少，提示RBP-J缺失導(dǎo)致神經(jīng)元提前分化和RPCs的耗竭；發(fā)育晚期，通過(guò)活體電穿孔在出生后小鼠視網(wǎng)膜中敲除Rbpj主要導(dǎo)致視桿細(xì)胞增加和Müller氏膠質(zhì)細(xì)胞減少。提示RBP-J參與調(diào)控感光細(xì)胞和Müller氏膠質(zhì)細(xì)胞的定

10、向分化。此外，在Rbpj缺失的視網(wǎng)膜中，層狀結(jié)構(gòu)的紊亂伴隨著視網(wǎng)膜外表面細(xì)胞粘附相關(guān)分子β-catenin的表達(dá)缺失。更為有趣的是，我們通過(guò)活體電穿孔在Rbpj缺失的視網(wǎng)膜中過(guò)表達(dá)β-catenin，觀察到視網(wǎng)膜正常層次結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。
　　Rbpj敲除小腦與野生型小鼠小腦相比體積顯著變小，分葉結(jié)構(gòu)消失。發(fā)育早期（E10.5、E12.5）小腦原基腦室區(qū)proneural基因Mash1表達(dá)上調(diào)，神經(jīng)元提前分化，增殖的NPCs顯著減少，表

11、明Notch-RBP-J信號(hào)途徑維持著小腦原基中NPCs的數(shù)量，并控制著小腦神經(jīng)細(xì)胞分化的時(shí)程。發(fā)育晚期浦肯野細(xì)胞和顆粒細(xì)胞持續(xù)性減少，小腦深部核團(tuán)幾乎消失。此外，Rbpj敲除小鼠中決定菱腦峽組織者（IsthmicOrganizer）建立和中后腦分界形成的重要因子在相應(yīng)區(qū)域均有表達(dá)，表明Rbpj表達(dá)失活對(duì)于IO的形成沒(méi)有顯著性影響，同時(shí)說(shuō)明Notch-RBP-J信號(hào)途徑對(duì)于小腦原基發(fā)育的調(diào)控作用是直接的，而并非間接的通過(guò)調(diào)節(jié)IO建立而發(fā)

12、揮影響。
　　上述研究結(jié)果共同揭示RBP-J所介導(dǎo)的經(jīng)典N(xiāo)otch信號(hào)途徑通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞分化(differentiation)，從而維持足夠的NSC/NPCs直至晚期發(fā)育；此外，Notch-RBP-J信號(hào)也參與神經(jīng)細(xì)胞定向（specification），發(fā)揮諸如抑制視網(wǎng)膜感光細(xì)胞分化，以及促進(jìn)Müller氏膠質(zhì)細(xì)胞形成的作用；在形態(tài)發(fā)生方面，RBP-J還可能通過(guò)調(diào)控粘附相關(guān)分子β-catenin的表達(dá)參與視網(wǎng)膜層次結(jié)構(gòu)形成；同時(shí)

13、，我們的研究證明RBP-J對(duì)于中后腦分界的形成沒(méi)有顯著影響。綜上所述，本課題的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子RBP-J通過(guò)介導(dǎo)經(jīng)典N(xiāo)otch信號(hào)途徑調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的定向、分化；并在特定發(fā)育環(huán)境中調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)形成，從而協(xié)調(diào)神經(jīng)發(fā)生（Neurogenesis）和形態(tài)形成（Morphogenesis）兩個(gè)發(fā)育過(guò)程，最終確保神經(jīng)系統(tǒng)正常的結(jié)構(gòu)形成及功能建立。這些研究對(duì)于深入理解神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的分子機(jī)理以及Notch信號(hào)全面的調(diào)控作用，以及了解相關(guān)人類(lèi)