UPR信號通路遺傳操作提高酵母異源表達.pdf

1、隨著后基因組時代的來臨,越來越多的蛋白質(zhì)開發(fā)成藥物或直接進行分析,這就需要獲得合適的宿主來進行異源表達。而為便于后續(xù)的純化過程,分泌性的表達宿主更為理想,雖然在畢赤酵母中獲得了較低成本的大量蛋白的異源表達,但因其存在著誘導(dǎo)時間長、受專利保護等因素的限制,國際上針對非常規(guī)酵母及絲狀真菌的研究逐漸成為熱點。
　　 UPR信號傳導(dǎo)是一個進化上保守的通路,尤其是在酵母和絲狀真菌中表現(xiàn)了相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的未折疊蛋白累積造成脅迫來自

2、然激活。通路上的轉(zhuǎn)錄因子Haclp在激活、維持這一信號途徑中起著關(guān)鍵作用,通過依賴于UPR信號響應(yīng)元件(UPRE)調(diào)節(jié)蛋白折疊或降解等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程,來緩解產(chǎn)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的這種脅迫。
　　 為了研究UPR信號的激活對異源表達的影響,我們首先克隆了溶菌酶基因并與α信號肽融合后在釀酒酵母中表達。建立了一個基于平板計數(shù)的穿梭質(zhì)粒拷貝數(shù)確定方法,通過質(zhì)粒的穩(wěn)定性及拷貝數(shù)的研究建立了一步培養(yǎng)的方法使溶菌酶快速表達、分析。
　　

3、 本文用逆轉(zhuǎn)錄方法克隆了HAC1icDNA,以不同拷貝數(shù)的載體或在基因組水平做HAC1的基因去內(nèi)含子擴增的方式介導(dǎo)UPR信號的持續(xù)激活,結(jié)果表明UPR信號激活提高異源表達的同時存在著劑量效應(yīng)。YEplac181介導(dǎo)的UPR激活提高異源表達程度最大,使溶菌酶的表達量跨越了微克級,提高到2.7 mg／L。
　　 本文建立了一個新的高通量異源表達菌株篩選系統(tǒng),本系統(tǒng)不依賴于流式細胞術(shù)及微孔板檢測儀。依據(jù)色譜原理,展示在細胞表面的CBD

4、或亮氨酸拉鏈與纖維素基質(zhì)的相互作用成為抵抗來至流動相的“篩選壓力”?；谶@個系統(tǒng),通過定向進化技術(shù)獲得了一個Hac1p突變子(Gly48,Gly111),記為Hac1Pm1,異源表達量達到了3.9 mg HEL／L。通過對比Hac1p m1與野生型結(jié)構(gòu)分析推測,氨基酸突變,由于空間位阻減小,可能導(dǎo)致其折疊發(fā)生改變,影響其功能。更為重要的是Arg4.8Gly不但打破了一段α螺旋,使肽鏈趨向改變走向,更使得亮氨酸拉鏈基序與DNA的作用發(fā)生改

5、變,導(dǎo)致突變子調(diào)節(jié)的靶基因發(fā)生變化。同時也導(dǎo)致實質(zhì)“劑量”與野生型相比降低,進而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化,導(dǎo)致異源表達量的提高。
　　 最后,我們通過分析UPR信號途徑在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平調(diào)節(jié)的靶基因性質(zhì),確定了UPR信號激活過程中菌體生長受抑制的主要因為是氧還平衡的破壞。為進一步提高異源表達量,通過UPRE介導(dǎo)的UPR信號擴增遺傳操作,利用KAR2啟動子替換MAE1啟動子并擴增于ura3基因座,以及敲除基因GPD2來維持氧還平