UPR信號(hào)通路遺傳操作提高酵母異源表達(dá).pdf

1、隨著后基因組時(shí)代的來臨,越來越多的蛋白質(zhì)開發(fā)成藥物或直接進(jìn)行分析,這就需要獲得合適的宿主來進(jìn)行異源表達(dá)。而為便于后續(xù)的純化過程,分泌性的表達(dá)宿主更為理想,雖然在畢赤酵母中獲得了較低成本的大量蛋白的異源表達(dá),但因其存在著誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)、受專利保護(hù)等因素的限制,國(guó)際上針對(duì)非常規(guī)酵母及絲狀真菌的研究逐漸成為熱點(diǎn)。
　　 UPR信號(hào)傳導(dǎo)是一個(gè)進(jìn)化上保守的通路,尤其是在酵母和絲狀真菌中表現(xiàn)了相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的未折疊蛋白累積造成脅迫來自

2、然激活。通路上的轉(zhuǎn)錄因子Haclp在激活、維持這一信號(hào)途徑中起著關(guān)鍵作用,通過依賴于UPR信號(hào)響應(yīng)元件(UPRE)調(diào)節(jié)蛋白折疊或降解等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程,來緩解產(chǎn)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的這種脅迫。
　　 為了研究UPR信號(hào)的激活對(duì)異源表達(dá)的影響,我們首先克隆了溶菌酶基因并與α信號(hào)肽融合后在釀酒酵母中表達(dá)。建立了一個(gè)基于平板計(jì)數(shù)的穿梭質(zhì)粒拷貝數(shù)確定方法,通過質(zhì)粒的穩(wěn)定性及拷貝數(shù)的研究建立了一步培養(yǎng)的方法使溶菌酶快速表達(dá)、分析。
　　

3、 本文用逆轉(zhuǎn)錄方法克隆了HAC1icDNA,以不同拷貝數(shù)的載體或在基因組水平做HAC1的基因去內(nèi)含子擴(kuò)增的方式介導(dǎo)UPR信號(hào)的持續(xù)激活,結(jié)果表明UPR信號(hào)激活提高異源表達(dá)的同時(shí)存在著劑量效應(yīng)。YEplac181介導(dǎo)的UPR激活提高異源表達(dá)程度最大,使溶菌酶的表達(dá)量跨越了微克級(jí),提高到2.7 mg／L。
　　 本文建立了一個(gè)新的高通量異源表達(dá)菌株篩選系統(tǒng),本系統(tǒng)不依賴于流式細(xì)胞術(shù)及微孔板檢測(cè)儀。依據(jù)色譜原理,展示在細(xì)胞表面的CBD

4、或亮氨酸拉鏈與纖維素基質(zhì)的相互作用成為抵抗來至流動(dòng)相的“篩選壓力”?；谶@個(gè)系統(tǒng),通過定向進(jìn)化技術(shù)獲得了一個(gè)Hac1p突變子(Gly48,Gly111),記為Hac1Pm1,異源表達(dá)量達(dá)到了3.9 mg HEL／L。通過對(duì)比Hac1p m1與野生型結(jié)構(gòu)分析推測(cè),氨基酸突變,由于空間位阻減小,可能導(dǎo)致其折疊發(fā)生改變,影響其功能。更為重要的是Arg4.8Gly不但打破了一段α螺旋,使肽鏈趨向改變走向,更使得亮氨酸拉鏈基序與DNA的作用發(fā)生改

5、變,導(dǎo)致突變子調(diào)節(jié)的靶基因發(fā)生變化。同時(shí)也導(dǎo)致實(shí)質(zhì)“劑量”與野生型相比降低,進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化,導(dǎo)致異源表達(dá)量的提高。
　　 最后,我們通過分析UPR信號(hào)途徑在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平調(diào)節(jié)的靶基因性質(zhì),確定了UPR信號(hào)激活過程中菌體生長(zhǎng)受抑制的主要因?yàn)槭茄踹€平衡的破壞。為進(jìn)一步提高異源表達(dá)量,通過UPRE介導(dǎo)的UPR信號(hào)擴(kuò)增遺傳操作,利用KAR2啟動(dòng)子替換MAE1啟動(dòng)子并擴(kuò)增于ura3基因座,以及敲除基因GPD2來維持氧還平