ERS和UPR信號通路在PBDE-47神經(jīng)毒性中的作用及其機制研究.pdf

1、多溴聯(lián)苯醚是一類溴代阻燃劑型化合物,被廣泛作為一類重要的工業(yè)阻燃添加劑加入高分子合成材料中,作為防火材料廣泛地應用于多種工業(yè)生產領域。由于沒有化學鍵的束縛,PBDEs易從產品中遷移出來進入環(huán)境介質,導致環(huán)境污染。目前,世界上很多國家已經(jīng)從空氣、水、土壤、食物等多種環(huán)境介質以及人群的血液、乳汁、脂肪等組織中發(fā)現(xiàn)了PBDEs的存在。由于PBDEs是一類持久性有機污染物,其在環(huán)境介質中的含量呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。
　　近年來,大量體內外的

2、實驗研究結果證實,PBDEs可引起神經(jīng)毒性、生殖毒性、肝腎毒性、免疫毒性和致癌性等。由于PBDEs可通過胎盤轉運和乳汁排泄、加上嬰幼兒特有的手-口行為和頻繁的地面接觸及排泄PBDEs能力較成年人差等原因,致使嬰幼兒體內PBDEs水平高于其它年齡段人群。嬰幼兒期是大腦快速發(fā)育時期,因而在PBDEs導致的多種毒性作用中,神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育毒性尤其受到人們的關注。動物實驗研究表明,在鼠大腦發(fā)育的關鍵期,暴露于于近似人體負荷量的PBDEs同系物,可

3、損害實驗動物腦部運動和認知區(qū)域,表現(xiàn)為自發(fā)行為異常,感覺運動障礙,學習記憶能力下降,并伴隨染毒劑量增加或年齡增長而呈現(xiàn)惡化的趨勢。PBDEs如何引起大腦形態(tài)和功能的異常是當前PBDEs神經(jīng)毒性作用研究的熱點之一,但PBDEs可通過哪些途徑影響自主行為和學習記憶的機制目前仍不清楚。
　　PBDEs可引起神經(jīng)細胞內的活性氧生成增多,產生氧化應激反應。氧化應激是細胞凋亡級聯(lián)反應中的始發(fā)因素,繼而誘導神經(jīng)細胞凋亡,產生神經(jīng)毒性作用。有關P

4、BDEs實驗研究結果表明,PBDEs可以引起神經(jīng)細胞由氧化應激介導的凋亡。神經(jīng)細胞異常過度的凋亡,必將引起神經(jīng)元結構和功能的改變,引發(fā)神經(jīng)細胞的毒性作用。因此,細胞凋亡是PBDEs引起神經(jīng)毒性作用的關鍵因素之一。
　　內質網(wǎng)通路是細胞凋亡三條經(jīng)典途徑之一。內質網(wǎng)是細胞進行蛋白質的正確折疊、組裝和運輸?shù)膱鏊?。當細胞受到體內外不同強度刺激,如氧化應激后,內質網(wǎng)將產生未折疊蛋白/錯誤折疊蛋白積聚,誘發(fā)內質網(wǎng)發(fā)生不同程度的內質網(wǎng)應激,激活

5、未折疊蛋白反應的信號通路。持續(xù)或過強的內質網(wǎng)應激,可引起內質網(wǎng)內環(huán)境的紊亂,從而通過UPR信號通路活化相關分子而介導細胞凋亡。
　　目前尚未見內質網(wǎng)應激和UPR信號通路參與PBDEs致神經(jīng)細胞凋亡的文獻報道。但新近研究發(fā)現(xiàn),PBDEs染毒大鼠海馬神經(jīng)元的內質網(wǎng)出現(xiàn)病理性改變;PBDEs的代謝產物可使染毒細胞UPR信號通路相關基因如葡萄糖調節(jié)蛋白78、生長抑制和DNA損傷誘導家族基因153、GADD34及X盒結合蛋白1的表達發(fā)生改變

6、。根據(jù)目前相關研究結果所提供的初步線索,推測PBDEs可能通過內質網(wǎng)應激和UPR信號通路導致神經(jīng)細胞凋亡從而引起神經(jīng)毒性。
　　基于上述理由,本課題利用在環(huán)境樣本和人體組織中含量最高、對生物和人體毒性作用最強的PBDEs同系物之一的2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(PBDE-47)作為目標受試物,將體外培養(yǎng)的具有神經(jīng)細胞特性的人神經(jīng)母細胞瘤細胞作為受試細胞進行體外實驗。采用流式細胞術、實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應、western

7、 blot和Hoechst33258細胞核染色等技術和方法,檢測神經(jīng)細胞ROS產生、細胞凋亡、神經(jīng)細胞GRP78、內質網(wǎng)膜感應蛋白IRE1、XBP1、c-jun N末端激酶和CHOP等基因mRNA和蛋白質的表達,并通過小分子干擾RNA沉默IRE1后檢測細胞凋亡、UPR通路相關分子的mRNA和蛋白表達的變化,探討 ERS與UPR細胞凋亡通路是否參與了PBDE-47致神經(jīng)細胞的毒性效應,明確IRE1通路在PBDE-47產生的神經(jīng)毒性中的作用

8、。以期在PBDE-47致神經(jīng)毒作用的分子機制研究方面獲得新的進展,為PBDEs對機體危害作用的預防控制提供基礎資料和理論依據(jù),具有重要的理論和實際意義。
　　第一部分 PBDE-47對SH-SY5Y細胞產生氧化損傷并誘導UPR及激活IRE1信號通路
　　目的:明確PBDE-47是否通過誘導SH-SY5Y細胞產生ERS和UPR而產生神經(jīng)毒性作用,為研究PBDE-47的神經(jīng)毒性作用機制提供線索。
　　方法:SH-SY5Y細

9、胞暴露于不同濃度的PBDE-47,在不同時間點(3,6,12,24h),應用流式細胞術檢測其ROS產生水平;應用real time RT-PCR技術和western blot技術分別檢測細胞內GRP78、IRE1、CHOP、JNK、磷酸化JNK(phosphor-JNK,p-JNK)、Bcl-2以及Bax等UPR中IRE1通路相關基因的mRNA和蛋白表達水平。
　　結果:與對照組相比,一定劑量的PBDE-47在3-24h內使SH-

10、SY5Y細胞ROS產生明顯增加(P<0.05)并具有一定的劑量-效應關系、GRP78和IRE1 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)并具有劑量-效應關系;用10μmol/L的PBDE-47處理SH-SY5Y細胞24h后IRE1和CHOP的蛋白表達水平均明顯高于0,3,6和12h的表達水平(P<0.05);不同濃度的PBDE-47處理SH-SY5Y細胞24h后,IRE1、CHOP和p-JNK蛋白表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)

11、,并具有濃度依賴性關系,Bcl-2蛋白表達水平較對照組明顯下降(P<0.05),Bax/Bcl-2比值較對照組顯著增加(p<0.01)。
　　結論:PBDE-47可能通過增加細胞內ROS產生而引起細胞氧化應激,并導致ERS發(fā)生和激活UPR,通過內質網(wǎng)凋亡通路對SH-SY5Y細胞產生神經(jīng)毒性作用。UPR信號轉導通路中的IRE1通路參與了PBDE-47所致的神經(jīng)毒性作用。
　　第二部分 IRE1信號通路在PBDE-47致SH-S

12、Y5Y細胞毒性中的作用及其機制研究
　　目的:由于IRE1是UPR中對細胞存活與死亡起決定意義的跨膜感應蛋白,IRE1具有重要的細胞凋亡調控作用,因此本研究旨在探討IRE1細胞凋亡通路在PBDE-47致SH-SY5Y細胞神經(jīng)毒性中的作用。
　　方法:應用siRNA技術將SH-SY5Y細胞IRE1基因沉默后再暴露于10μmol/L PBDE-4724h,利用光鏡和倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)以及經(jīng)Hoechst核染色的細胞核形態(tài)

13、;利用流式細胞術測定細胞凋亡,使用real time RT-PCR技術和western blot技術檢測細胞內GRP78、IRE1、非剪切形式XBP1-XBP1u、剪切形式XBP1-XBP1s、CHOP、JNK、p-JNK、Bcl-2以及Bax等UPR中IRE1通路凋亡相關基因的mRNA和蛋白表達水平。
　　結果:PBDE-47引起SH-SY5Y細胞體積收縮、呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)變化,活細胞數(shù)量減少;核染色質呈現(xiàn)濃積、片斷化、核破裂和細

14、胞空泡樣等改變,并可見凋亡小體。沉默 IRE1基因后,PBDE-47引起細胞的凋亡性形態(tài)改變明顯增加(P<0.05)。流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn),PBDE-47可顯著增加細胞凋亡率(P<0.05),沉默IRE1基因后PBDE-47引起的細胞凋亡率進一步增加(P<0.05)。與對照組相比,PBDE-47顯著升高 XBP1u、XBP1s、CHOP、JNK和Bax的mRNA表達水平(P<0.05或P<0.01),明顯降低Bcl-2的mRNA表達水

15、平(P<0.05);與陰性對照+PBDE-47組相比,沉默IRE1基因后,用PBDE-47處理的細胞XBP1s、CHOP、JNK和Bcl-2 mRNA表達水平顯著下降(P<0.05或 P<0.01),但Bax mRNA表達水平卻顯著升高(P<0.05),Bax/Bcl-2比值明顯增加(P<0.05)。與陰性對照+PBDE-47組相比,沉默IRE1基因后,用PBDE-47處理的細胞CHOP、JNK和Bcl-2蛋白表達水平明顯下調(P<0.

16、05),但Bax蛋白水平顯著上升(P<0.05),Bax/Bcl-2比值均明顯增加(P<0.01)。
　　結論:IRE1通過上調XBP1s、JNK和CHOP的表達激活相關細胞信號通路,從而對細胞具有抵抗內質網(wǎng)應激和促進細胞凋亡的雙重作用;Bcl-2表達水平下調和Bax表達水平上升,Bax/Bcl-2比值顯著升高是沉默IRE1后PBDE-47引起SH-SY5Y細胞凋亡增加的重要原因。在24h,IRE1對PBDE-47引起的SH-SY