2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩108頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、MicroRNAs(miRNAs)通過抑制靶基因的翻譯在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究已經發(fā)現(xiàn)有多種miRNAs與非小細胞肺癌(non-small-celllungcancer,NSCLS)的發(fā)生有密切關系,但是miR-136在NSCLC中的作用目前還不清楚。我們在本研究中發(fā)現(xiàn),miR-136在NSCLC腫瘤組織中的表達顯著上調。通過對多種NSCLC細胞株進行檢測發(fā)現(xiàn),與正常細胞株相比,NSCLC細胞株中miR-136的表達均有不

2、同程度的增加。抑制NSCLC細胞株A549中miR-136的表達能夠抑制該腫瘤細胞的錨定依賴性和非錨定依賴性增殖。同時,我們還發(fā)現(xiàn)miR-136促進NSCLC細胞的增殖與胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular-signal-regulatedkinase1/2,Erk1/2)的活化有關。采用anti-miR-136抑制miR-136的表達后Erk1/2的磷酸化水平顯著降低。通過信息生物學方法結合熒光素酶報告基因分析的方法我們

3、發(fā)現(xiàn),絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A55Kda調節(jié)亞基Bα(serine/threonineproteinphosphatase2A55kDaregulatorysubunitBαisoform,PPP2R2A,B55α)是miR-136的一個直接靶基因,抑制miR-136的表達能夠顯著上調PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白的表達水平。在NSCLC細胞中過表達PPP2R2A后miR-136引起的ERK1/2活化受到抑制,同時miR

4、-136引起的細胞增殖也受到抑制。對NSCLC組織進行免疫組化分析的結果也發(fā)現(xiàn),PPP2R2A在NSCLC組織中的表達明顯低于正常的癌旁組織。說明,miR-136是通過抑制PPP2R2A的表達促進ERK1/2的磷酸化,總之,本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC中,miR-136通過抑制PPP2R2A促進ERK1/2的活化,從而促進細胞的增殖,提示其可能成為臨床NSCLC治療的一個有效靶點。
  第一部分miR-136在NSCLC腫瘤組織及細胞株

5、中的表達
  方法:
  1.采用q-PCR的方法對37對NSCLC腫瘤組織,及其相應的癌旁組織中miR-136的表達情況進行分析。并采用q-PCR方法對NSCLC細胞系A549,SPC-A1,NCI-H1299和正常支氣管上皮細胞系16HBE中miR-136的表達進行檢測
  2.采用原位雜交的方法檢測了miR-136在NSCLC組織中的表達。
  3.統(tǒng)計學處理:應用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)用均數(shù)±

6、標準差(x±s),兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗;兩個有序變量之間的相關性檢驗用Spearman相關分析,兩分類變量的比較用Pearson'sx2檢驗;以α=0.05為檢驗水準。P<0.05時有統(tǒng)計學意義。
  結果:
  1.q-PCR和原位雜交的檢測結果均顯示,與相應的正常組織相比,在NSCLC腫瘤組織中,miR-136的表達顯著增加。通過對患者臨床病理學特征進行分析發(fā)現(xiàn),miR-136的表達與患者的性別和年齡沒有明顯

7、的關系,但是,在腺癌中的表達要高于鱗狀細胞癌。另外,miR-136的表達水平與腫瘤是否發(fā)生淋巴結轉移沒有明顯的關系,但是和腫瘤的分化程度呈負相關。
  2.q-PCR的檢測結果顯示,與正常支氣管上皮細胞株16HBE相比,NSCLC細胞株A549,SPC-A1,NCI-H1650和NCI-H1299中miR-136的表達均有不同程度的上調,其中在A549中的表達增加最為顯著。
  第二部分miR-136上調激活Erk1/2促進

8、NSCLC細胞的增殖
  方法:
  1.采用脂質體轉染的方法將miRNA抑制劑轉染至NSCLC細胞中,抑制miR-136的表達,并采用q-PCR的方法驗證抑制效果。
  2.采用MTT分析和軟瓊脂克隆形成實驗檢測miR-136對NSCLC細胞的增殖能力的影響。
  3.采用westernblot的方法檢測抑制NSCLC中的miR-136對Erk1/2信號通路的影響。
  4.運用免疫組織化學的方法檢測NS

9、CLC組織中Erk1/2信號通路的活化情況。
  5.統(tǒng)計學處理:應用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s),采用one-wayANOVA與student'st檢驗各組間差異的顯著性,P<0.05時有統(tǒng)計學意義。
  結果:
  1.與對照組相比,轉染了miR-136抑制劑anti-miR-136三天和五天之后,NSCLC細胞中miR-136的量分別下降了75%和64%(P<0.05)。
  

10、2.MTT分析實驗結果顯示:抑制NSCLC細胞A549中miR-136的表達量之后,細胞的增殖能力顯著下降,與對照組相比,轉染了anti-miR-136之后第5天細胞的存活率下降至71%(P<0.05)。
  3.軟瓊脂克隆形成實驗結果顯示:抑制A549細胞中miR-136的表達之后,細胞的克隆形成能力顯著下降。與對照組相比,轉染了anti-miR-136的細胞形成的克隆數(shù)減少了62%(P<0.05)。
  4.wester

11、nblot檢測結果顯示:抑制A549細胞中miR-136的表達使Erk1/2以劑量依賴的方式降低活性。轉染40nM的anti-miR-13672小時后,90%的Erk1/2磷酸化受到抑制。
  5.免疫組織化學檢測結果顯示:在NSCLC組織中,Erk1/2的磷酸化上調與miR-136的表達上調相一致。與相應的癌旁正常組織相比,NSCLC組織中Erk1/2的磷酸化水平明顯增高。
  第三部分miR-136激活Erk1/2促進N

12、SCLC細胞增殖的機制研究
  方法:
  1.利用PicTar和TargetScan軟件進行分析預測miR-136的靶基因,并用熒光素酶報告基因分析的方法進行驗證。
  2.采用轉染結合q-PCR或Westernblot的分別檢測miR-136對A549細胞中PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白表達的影響。
  3.采用q-PCR和westemblot的方法檢測NSCLC組織中PPP2R2AmRNA和PP

13、P2R2A蛋白的表達情況。
  4.結合臨床病理資料分析PPP2R2A表達與患者臨床病理特征是否有關聯(lián)。
  5.通過在A549細胞中單獨過表達miR-136或者共同過表達PPP2R2A,結合westemblot檢測miR-136對Erk1/2的活化是否與PPP2R2A有關。
  6.通過在A549細胞中單獨過表達miR-136或者共同過表達PPP2R2A,結合MTT實驗檢測PPP2R2A是否影響miR-136誘導的細

14、胞增殖。
  7.統(tǒng)計學處理:應用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s),采用one-wayANOVA與student'st檢驗各組間差異的顯著性,P<0.05時有統(tǒng)計學意義。兩個有序變量之間的相關性檢驗用Spearman相關分析,兩分類變量的比較用Pearson'sx2檢驗;以α=0.05為檢驗水準。P<0.05時有統(tǒng)計學意義。
  結果:
  1.PicTar和TargetScan軟件分析預測:

15、結果發(fā)現(xiàn)PPP2R2AmRNA3'UTR含有miR-136的可能結合位點,是miR-136的一個重要靶基因。
  2.熒光素酶分析實驗:結果發(fā)現(xiàn),與對照miRNA相比,在A549中miR-136能夠顯著抑制含有野生型-3'UTR報告載體的熒光素酶活性,而對含有突變型-3'UTR的報告載體的熒光素酶活性沒有影響。
  3.q-PCR和westemblot檢測:結果顯示,抑制miR-136的表達后A549細胞中PPP2R2AmR

16、NA和PPP2R2A蛋白的表達水平均明顯增加。
  4.q-PCR和westemblot檢測:結果顯示,與正常組織相比,在NSCLC組織中PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白的表達降低,而且與miR-136的表達呈負相關。
  5.病理學分析:結果提示miR-136表達與患者的年齡,性別及TNM級別沒有直接的關聯(lián),但是,PPP2R2A與腫瘤的組織學分級有重要關系。
  6.在A549細胞中過表達miR-136,P

17、PP2R2A的表達受到抑制,同時Erk1/2磷酸化水平上調。而共同過表達miR-136和PPP2R2A后,A549細胞中由miR-136誘導的Erk1/2磷酸化受到抑制。
  7.在A549細胞中過表達miR-136,細胞增殖增加32%,而同時過表達miR-136和PPP2R2A后細胞增殖減少了44%。
  結論:
  1.miR-136在NSCLC組織及NSCLC細胞株中表達上調,提示miR-136的高表達與NSCL

18、C的發(fā)生有關。
  2.抑制miR-136的表達能夠抑制NSCLC細胞的增殖,其作用機制可能與抑制Erk1/2的激活有關。
  3.PPP2R2A是miR-136的靶基因,在NSCLC細胞株A549中抑制miR-136的表達,PPP2R2A的表達顯著增加。
  4.過表達miR-136能夠促進A549細胞的增殖,而同時過表達PPP2R2A則使miR-136誘導的細胞增殖發(fā)生逆轉。
  5.miR-136通過抑制P

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論