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文檔簡介
1、MicroRNAs(miRNAs)通過抑制靶基因的翻譯在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究已經發(fā)現(xiàn)有多種miRNAs與非小細胞肺癌(non-small-celllungcancer,NSCLS)的發(fā)生有密切關系,但是miR-136在NSCLC中的作用目前還不清楚。我們在本研究中發(fā)現(xiàn),miR-136在NSCLC腫瘤組織中的表達顯著上調。通過對多種NSCLC細胞株進行檢測發(fā)現(xiàn),與正常細胞株相比,NSCLC細胞株中miR-136的表達均有不
2、同程度的增加。抑制NSCLC細胞株A549中miR-136的表達能夠抑制該腫瘤細胞的錨定依賴性和非錨定依賴性增殖。同時,我們還發(fā)現(xiàn)miR-136促進NSCLC細胞的增殖與胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular-signal-regulatedkinase1/2,Erk1/2)的活化有關。采用anti-miR-136抑制miR-136的表達后Erk1/2的磷酸化水平顯著降低。通過信息生物學方法結合熒光素酶報告基因分析的方法我們
3、發(fā)現(xiàn),絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A55Kda調節(jié)亞基Bα(serine/threonineproteinphosphatase2A55kDaregulatorysubunitBαisoform,PPP2R2A,B55α)是miR-136的一個直接靶基因,抑制miR-136的表達能夠顯著上調PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白的表達水平。在NSCLC細胞中過表達PPP2R2A后miR-136引起的ERK1/2活化受到抑制,同時miR
4、-136引起的細胞增殖也受到抑制。對NSCLC組織進行免疫組化分析的結果也發(fā)現(xiàn),PPP2R2A在NSCLC組織中的表達明顯低于正常的癌旁組織。說明,miR-136是通過抑制PPP2R2A的表達促進ERK1/2的磷酸化,總之,本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC中,miR-136通過抑制PPP2R2A促進ERK1/2的活化,從而促進細胞的增殖,提示其可能成為臨床NSCLC治療的一個有效靶點。
第一部分miR-136在NSCLC腫瘤組織及細胞株
5、中的表達
方法:
1.采用q-PCR的方法對37對NSCLC腫瘤組織,及其相應的癌旁組織中miR-136的表達情況進行分析。并采用q-PCR方法對NSCLC細胞系A549,SPC-A1,NCI-H1299和正常支氣管上皮細胞系16HBE中miR-136的表達進行檢測
2.采用原位雜交的方法檢測了miR-136在NSCLC組織中的表達。
3.統(tǒng)計學處理:應用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)用均數(shù)±
6、標準差(x±s),兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗;兩個有序變量之間的相關性檢驗用Spearman相關分析,兩分類變量的比較用Pearson'sx2檢驗;以α=0.05為檢驗水準。P<0.05時有統(tǒng)計學意義。
結果:
1.q-PCR和原位雜交的檢測結果均顯示,與相應的正常組織相比,在NSCLC腫瘤組織中,miR-136的表達顯著增加。通過對患者臨床病理學特征進行分析發(fā)現(xiàn),miR-136的表達與患者的性別和年齡沒有明顯
7、的關系,但是,在腺癌中的表達要高于鱗狀細胞癌。另外,miR-136的表達水平與腫瘤是否發(fā)生淋巴結轉移沒有明顯的關系,但是和腫瘤的分化程度呈負相關。
2.q-PCR的檢測結果顯示,與正常支氣管上皮細胞株16HBE相比,NSCLC細胞株A549,SPC-A1,NCI-H1650和NCI-H1299中miR-136的表達均有不同程度的上調,其中在A549中的表達增加最為顯著。
第二部分miR-136上調激活Erk1/2促進
8、NSCLC細胞的增殖
方法:
1.采用脂質體轉染的方法將miRNA抑制劑轉染至NSCLC細胞中,抑制miR-136的表達,并采用q-PCR的方法驗證抑制效果。
2.采用MTT分析和軟瓊脂克隆形成實驗檢測miR-136對NSCLC細胞的增殖能力的影響。
3.采用westernblot的方法檢測抑制NSCLC中的miR-136對Erk1/2信號通路的影響。
4.運用免疫組織化學的方法檢測NS
9、CLC組織中Erk1/2信號通路的活化情況。
5.統(tǒng)計學處理:應用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s),采用one-wayANOVA與student'st檢驗各組間差異的顯著性,P<0.05時有統(tǒng)計學意義。
結果:
1.與對照組相比,轉染了miR-136抑制劑anti-miR-136三天和五天之后,NSCLC細胞中miR-136的量分別下降了75%和64%(P<0.05)。
10、2.MTT分析實驗結果顯示:抑制NSCLC細胞A549中miR-136的表達量之后,細胞的增殖能力顯著下降,與對照組相比,轉染了anti-miR-136之后第5天細胞的存活率下降至71%(P<0.05)。
3.軟瓊脂克隆形成實驗結果顯示:抑制A549細胞中miR-136的表達之后,細胞的克隆形成能力顯著下降。與對照組相比,轉染了anti-miR-136的細胞形成的克隆數(shù)減少了62%(P<0.05)。
4.wester
11、nblot檢測結果顯示:抑制A549細胞中miR-136的表達使Erk1/2以劑量依賴的方式降低活性。轉染40nM的anti-miR-13672小時后,90%的Erk1/2磷酸化受到抑制。
5.免疫組織化學檢測結果顯示:在NSCLC組織中,Erk1/2的磷酸化上調與miR-136的表達上調相一致。與相應的癌旁正常組織相比,NSCLC組織中Erk1/2的磷酸化水平明顯增高。
第三部分miR-136激活Erk1/2促進N
12、SCLC細胞增殖的機制研究
方法:
1.利用PicTar和TargetScan軟件進行分析預測miR-136的靶基因,并用熒光素酶報告基因分析的方法進行驗證。
2.采用轉染結合q-PCR或Westernblot的分別檢測miR-136對A549細胞中PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白表達的影響。
3.采用q-PCR和westemblot的方法檢測NSCLC組織中PPP2R2AmRNA和PP
13、P2R2A蛋白的表達情況。
4.結合臨床病理資料分析PPP2R2A表達與患者臨床病理特征是否有關聯(lián)。
5.通過在A549細胞中單獨過表達miR-136或者共同過表達PPP2R2A,結合westemblot檢測miR-136對Erk1/2的活化是否與PPP2R2A有關。
6.通過在A549細胞中單獨過表達miR-136或者共同過表達PPP2R2A,結合MTT實驗檢測PPP2R2A是否影響miR-136誘導的細
14、胞增殖。
7.統(tǒng)計學處理:應用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s),采用one-wayANOVA與student'st檢驗各組間差異的顯著性,P<0.05時有統(tǒng)計學意義。兩個有序變量之間的相關性檢驗用Spearman相關分析,兩分類變量的比較用Pearson'sx2檢驗;以α=0.05為檢驗水準。P<0.05時有統(tǒng)計學意義。
結果:
1.PicTar和TargetScan軟件分析預測:
15、結果發(fā)現(xiàn)PPP2R2AmRNA3'UTR含有miR-136的可能結合位點,是miR-136的一個重要靶基因。
2.熒光素酶分析實驗:結果發(fā)現(xiàn),與對照miRNA相比,在A549中miR-136能夠顯著抑制含有野生型-3'UTR報告載體的熒光素酶活性,而對含有突變型-3'UTR的報告載體的熒光素酶活性沒有影響。
3.q-PCR和westemblot檢測:結果顯示,抑制miR-136的表達后A549細胞中PPP2R2AmR
16、NA和PPP2R2A蛋白的表達水平均明顯增加。
4.q-PCR和westemblot檢測:結果顯示,與正常組織相比,在NSCLC組織中PPP2R2AmRNA和PPP2R2A蛋白的表達降低,而且與miR-136的表達呈負相關。
5.病理學分析:結果提示miR-136表達與患者的年齡,性別及TNM級別沒有直接的關聯(lián),但是,PPP2R2A與腫瘤的組織學分級有重要關系。
6.在A549細胞中過表達miR-136,P
17、PP2R2A的表達受到抑制,同時Erk1/2磷酸化水平上調。而共同過表達miR-136和PPP2R2A后,A549細胞中由miR-136誘導的Erk1/2磷酸化受到抑制。
7.在A549細胞中過表達miR-136,細胞增殖增加32%,而同時過表達miR-136和PPP2R2A后細胞增殖減少了44%。
結論:
1.miR-136在NSCLC組織及NSCLC細胞株中表達上調,提示miR-136的高表達與NSCL
18、C的發(fā)生有關。
2.抑制miR-136的表達能夠抑制NSCLC細胞的增殖,其作用機制可能與抑制Erk1/2的激活有關。
3.PPP2R2A是miR-136的靶基因,在NSCLC細胞株A549中抑制miR-136的表達,PPP2R2A的表達顯著增加。
4.過表達miR-136能夠促進A549細胞的增殖,而同時過表達PPP2R2A則使miR-136誘導的細胞增殖發(fā)生逆轉。
5.miR-136通過抑制P
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