同源盒蛋白Hhex的表達與肝細胞癌相關性的研究.pdf

1、肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是肝臟原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)生和發(fā)展與調節(jié)細胞增殖、分化的生長因子和轉錄因子有著極為密切的關系。同源盒蛋白家族中的造血細胞特異表達同源盒基因(hematopoietically expressed homeobox，Hhex)編碼的蛋白作為一種轉錄因子，不僅參與多種器官發(fā)育和分化的過程，而且對肝芽的形成以及肝系和膽系的分化都具有相當重要的作用。成體肝臟中，Hhex僅在成熟

2、的肝細胞中表達，具有維持肝細胞分化的作用。最近有研究表明，多種組織惡性病變的發(fā)生都與Hhex異常表達有關，例如人類白血病的發(fā)生與Hhex的低表達有關，T淋巴細胞瘤的發(fā)生則與Hhex的過表達相關。但是，關于Hhex與肝細胞癌發(fā)生的相關研究較少。已有研究顯示，Hhex mRNA在高分化的肝癌細胞系表達量較高，在低分化的肝癌細胞系不表達。本研究旨在探討Hhex的表達與肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展之間的關系，以期為揭示肝臟腫瘤發(fā)生的機制奠定基礎，并為肝細

3、胞癌的治療和診斷提供新的靶點。
　　 本研究在小鼠肝癌細胞系Hepa1—6中采用腺病毒轉染系統(tǒng)來介導Hhex表達，觀察Hhex對Hepa1—6細胞的體外生物學特性及體內成瘤能力的影響，并在42例人肝細胞癌組織中分析了HHEX的表達與不同分化狀態(tài)的肝細胞癌間的關系，結果如下：
　　 一、Hhex能夠抑制Hepa1—6細胞的體外生長和克隆形成率
　　 運用攜帶Hhex基因的腺病毒載體(命名為Ad—Hhex)感染293

4、LP細胞后，通過RT—PCR和Western Blot的方法可以檢測到Ad—Hhex感染的Hepa1—6細胞中含有目的基因與蛋白，但是對照組沒有檢測到。光鏡觀察Ad—Hhex感染的Hepa1—6細胞變大，多核細胞率增多，核質比降低。MTT法對生長曲線的分析比較發(fā)現Hhex可以明顯抑制Hepa1—6細胞的增殖。檢測體外克隆形成率分析顯示Ad—Hhex感染的Hepa1—6細胞的克隆形成率明顯低于對照組。流式細胞分析也證明了Ad—Hhex感染

5、的Hepa1—6細胞的凋亡率多于對照組。以上結果表明Hhex對小鼠肝癌細胞系Hepa1—6的體外增殖具有抑制作用。
　　 二、Hhex可以誘導Hepa1—6細胞的部分分化并降低EpCAM陽性率
　　 通過RT—PCR檢測Ad—Hhex感染的Hepa1—6細胞中的抑癌基因(如P53、Rb)表達上調，原癌基因(如c—Jun、Bc12)表達下調。肝系標志(如ALB、GS、TAT、Pck1和Cypla2)和膽系標志(CK7和CK

6、19)以及肝臟早期發(fā)育相關性基因(AFP和HNF4α)的表達均上調，結果顯示Hhex可以誘導Hepa1—6的部分分化，進一步提示Hhex可以減弱Hepa1—6的惡變程度。同時，細胞免疫化學分析一個肝癌“干細胞”候選指標EpCAM在Hepa1—6細胞中的表達，結果顯示Ad—Hhex感染的Hepa1—6細胞中EpCAM的陽性細胞率低于對照組。
　　 三、Hhex抑制Hepa1—6細胞的體內成瘤能力
　　 為了評估Hhex對體

7、內腫瘤形成的影響，將Ad—Hhex感染的Hepa1—6和空病毒感染的Hepa1—6細胞(對照組)分別注入裸鼠腹部兩側。9天后，在注射部位發(fā)現肉眼可見的腫瘤，但注射感染Ad—Hhex的Hepa1—6細胞部位的腫瘤生長速度明顯慢于注射對照組部位生長的腫瘤速度。11天后，注射對照組的部位發(fā)現明顯壞死、潰爛的組織，但注射Ad—Hhex感染的Hepa1—6細胞部位沒有出現壞死、潰爛的組織。13天后，對不同部位生長的腫瘤計數，結果顯示注射Ad—Hh

8、ex感染的Hepa1—6細胞部位所生長的腫瘤數量少于注射對照組部位生長的腫瘤數量。
　　 四、在不同分化狀態(tài)的肝細胞癌中HHEX表達水平不同
　　 為了探求HHEX與不同分化狀態(tài)的肝細胞癌的關系，通過免疫組織化學的方法分析42例不同分化狀態(tài)人肝細胞癌中HHEX的表達情況。結果顯示HHEX在肝細胞癌的癌旁組織(n=19)與高分化肝細胞癌(n=8)的胞漿中高表達，在部分低分化肝細胞癌的胞漿中低表達或者不表達(n=13)，在少

9、數低分化肝細胞癌(n=2)的胞核中表達。該結果提示HHEX在胞漿中的表達可能與肝細胞癌的分化狀態(tài)具有正相關性。
　　 本研究通過腺病毒轉染系統(tǒng)使Hhex基因能夠在小鼠肝癌細胞系Hepa1—6中高效的表達；證明Hhex基因過表達可以使小鼠肝癌細胞系Hepa1—6惡變程度降低(生長抑制、成熟的分子標志表達增強，原癌基因標志表達減少，抑癌基因標志表達增強等)；人肝細胞癌免疫組織化學分析顯示HHEX在胞漿中的表達可能與肝細胞癌的分化程度