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文檔簡介
1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)的發(fā)病率在近幾年呈穩(wěn)步上升趨勢。作為ESRD的主要病因之一,DN的預(yù)防和治療越來越受到研究者的重視。在腎小球的三種固有細(xì)胞中,足細(xì)胞是濾過屏障的重要成分之一,具有特殊的細(xì)胞生物學(xué)特點和生理功能。足細(xì)胞損傷導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生,而DN以蛋白尿為主要臨床特征,說明足細(xì)胞的損傷推動DN的發(fā)展。
Podocalyxin(PCX)是與CD34及endoglycan密切相關(guān)的唾液
2、蛋白,表達(dá)于腎臟足細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、血管內(nèi)皮及神經(jīng)元亞群。PCX在腎臟位于足細(xì)胞的頂膜區(qū),所攜帶的負(fù)電荷使相鄰的足突分開形成裂孔隔膜(slitdiaphragms,SD),其抗細(xì)胞相互黏附的特性保持了濾過膜的開放。DNl的高糖環(huán)境可直接抑制PCX的表達(dá),從而使帶負(fù)電荷的白蛋白更易濾過,另外,PCX表達(dá)減少使細(xì)胞與細(xì)胞之間抗粘附作用降低,進(jìn)而加快蛋白尿的發(fā)展進(jìn)程。
WT1是一種鋅指樣轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,對大量的基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。研
3、究發(fā)現(xiàn)PCX是WT1的直接下游區(qū)靶目標(biāo),WT1可以結(jié)合于PCX基因啟動子保守序列,從而具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活力。而WT1本身也是足細(xì)胞的特異標(biāo)志之一,對維持足細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)及功能有重要作用。
Desmin是慢性腎小球病時足細(xì)胞損傷的早期標(biāo)志物之一。正常情況下,desmin主要位于系膜細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞,足細(xì)胞中很少,當(dāng)足細(xì)胞損傷時可見表達(dá)增強(qiáng)。
本課題擬通過鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)建立糖尿
4、病Sprague Dawley(SD)大鼠模型,應(yīng)用舒洛地特及貝那普利干預(yù)糖尿病大鼠,通過免疫組織化學(xué)、反轉(zhuǎn)錄PCR、電鏡等方法觀察舒洛地特對其足細(xì)胞中podocalyxin、WT1及desmin表達(dá)水平的變化,探討舒洛地特是否可以改善糖尿病大鼠足細(xì)胞的異常結(jié)構(gòu)及電荷屏障功能障礙,從而降低蛋白尿、延緩腎衰的發(fā)生,為人類糖尿病腎病的早期預(yù)防及尋找新的治療策略提供實驗性理論依據(jù)。
方法:清潔級健康雄性SD大鼠,體重約180~200
5、g,共60只,隨機(jī)抽出12只作為正常對照組(N組),剩余大鼠腹腔注射STZ(溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液,濃度2%,pH值4.5,注射劑量65mg/kg)方法制備糖尿病大鼠模型,48小時后測定血糖、尿糖,血糖≥16.7mmol/L且尿糖持續(xù)陽性確定為糖尿病大鼠模型。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組(D組),貝那普利組(B組),舒洛地特組(S組),貝那普利聯(lián)合舒洛地特組(B+S組),每組12只。N組只注射相同體積的檸檬酸緩沖液。B
6、組給予貝那普利10 mg·kg-1·d-1灌胃,S組給予舒洛地特10 mg·kg-1·d-1灌胃,B+S組給予貝那普利10 mg·kg-1·d-1及舒洛地特10 mg·kg-1·d-1灌胃,N組與D組給予等量的生理鹽水灌胃。整個實驗期間大鼠自由飲食,不使用胰島素及其它降糖藥物。分別于造模成功后6、12周收集血、尿及腎組織標(biāo)本,測定24小時尿蛋白定量、血肌酐及尿素;石蠟切片行免疫組化染色檢測腎組織中podocalyxin、desmin表達(dá)
7、情況;行RT-PCR檢測上述因子mRNA表達(dá)水平;行透射電鏡觀察糖尿病大鼠足細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示,組間差異性比較采用單因素方差分析,顯著性水平等于0.05,應(yīng)用SPSS13.0軟件包對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
結(jié)果:
1.一般情況D組、B組、S組及B+S組大鼠注射STZ后4~5天即出現(xiàn)多飲、多食、多尿,逐漸消瘦,其中D組癥狀及體重減輕最明顯,而N組則無上述情況出現(xiàn)。
2.各組大鼠24
8、小時尿蛋白定量、血肌酐及尿素的比較12周末D組小鼠尿蛋白定量、血肌酐和尿素升高最明顯(P<0.01),B組、S組、B+S組升高次之(P<0.05),但S組、B組未見明顯差異(P>0.05)。
3.免疫組織化學(xué)結(jié)果6周和12周末D組、B組、S組及B+S組大鼠腎組織中podocalyxin、desmin表達(dá)與N組相比,podocalyxin表達(dá)減弱,desmin表達(dá)增強(qiáng),其中12周末差別更為顯著(P<0.01);D組與B組、S組、
9、B+S組相比,腎組織中podocalyxin水平進(jìn)一步降低,desmin水平進(jìn)一步升高,12周末變化趨勢更顯著(P<0.01);B+S組大鼠腎組織中podocalyxin較同期B組和S組增強(qiáng)(P<0.05),desmin表達(dá)弱于同期B組和S組(P<0.05);B組與S組相比,大鼠腎組織中podocalyxin、desmin表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。
4.Reverse Transcription-PCR(RT-PCR)結(jié)
10、果與同期正常大鼠相比,糖尿病大鼠腎組織中podocalyxin、WT1的mRNA表達(dá)降低,desmin的mRNA表達(dá)升高,12周末變化更顯著(P<0.01);S+B組分別與B組和S組比較,podocalyxin、WT1的mRNA表達(dá)升高,desmin的mRNA表達(dá)降低(P<0.05);B組與S組相比,大鼠腎組織中podocalyxin、WT1及desmin表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。
5.透射電鏡結(jié)果與同期正常大鼠相比,D
11、組、B組、S組及B+S組均可見腎小球基底膜節(jié)段性增厚,伴內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,伴足突融合,但后三組足突融合較前明顯緩解。
結(jié)論:
1.糖尿病腎病時podocalyxin、WT1表達(dá)下降,與蛋白尿呈負(fù)相關(guān),desmin表達(dá)上升,與蛋白尿呈正相關(guān),提示podocalyxin、WT1及desmin在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。
2.舒洛地特能夠明顯減輕了糖尿病大鼠蛋白尿、延緩腎衰發(fā)生,其機(jī)制與上調(diào)podocaly
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