SLFN11基因表達(dá)水平影響人腸癌細(xì)胞株對(duì)SN38的敏感性.pdf

1、目的:
　　結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種常見(jiàn)的發(fā)病率及死亡率較高的惡性腫瘤，化療在其治療手段中占有重要地位。CPT-11是CRC的主要治療藥物之一，但是其療效因耐藥性的產(chǎn)生和毒性反應(yīng)受到限制。目前尚未有明確的CPT-11療效預(yù)測(cè)因子。因此找出CPT-11療效預(yù)測(cè)因子，對(duì)于指導(dǎo)CRC患者個(gè)體化治療，具有重要的意義。
　　近兩年體外研究發(fā)現(xiàn)SLFN11基因表達(dá)水平與CPT-11敏感性高度相關(guān)。SL

2、FN11基因是SLFN(Schlafen)家族中人源性成員之一。1998年， Schwarz等研究者發(fā)現(xiàn)SLFN家族基因SLFN1，參與調(diào)控胸腺發(fā)育。隨后不斷發(fā)現(xiàn)的SLFN家族其它成員的主要功能是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。SLFN基因家族因?yàn)閷?duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起重要的負(fù)調(diào)控作用，因此很可能是一種潛在的抑癌基因。SLFN11在多種腫瘤細(xì)胞系中廣泛表達(dá)，而且表達(dá)水平具有一定的分布范圍。在卵巢癌和CRC中，腫瘤組織的SLFN11分布明顯大于周圍的正常組織。

3、研究者通過(guò)大規(guī)模腫瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)SLFN11基因高表達(dá)細(xì)胞對(duì)CPT-11的療效好;但機(jī)制尚不明確。
　　本研究旨在對(duì)人源性結(jié)直腸癌細(xì)胞系進(jìn)行SLFN11基因功能與CPT-11的敏感性的相關(guān)研究。進(jìn)一步觀察SLFN11基因表達(dá)對(duì)腸癌細(xì)胞系的CPT-11敏感性的影響，為探索CPT-11療效預(yù)測(cè)分子提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　(1)實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot法檢測(cè)八種人腸癌細(xì)胞株（LOVO、H

4、CT-8、HT-29、SW-480、DiFi、HCT-116、CaCo2、、LS174T）中SLFN11的mRNA及蛋白表達(dá)水平。篩選出SLFN11表達(dá)高、低細(xì)胞株。
　　(2)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SLFN11 siRNA至細(xì)胞株，獲得低表達(dá)SLFN11的體外細(xì)胞研究模型。采用Western blot等技術(shù)驗(yàn)證下調(diào)SLFN11的效果。
　　(3)轉(zhuǎn)化SLFN11基因至HCT8細(xì)胞株。構(gòu)建pcDNA3.1(+)-SLFN11質(zhì)粒和E

5、XN91 mAb標(biāo)記的負(fù)電荷AuNP載體。設(shè)同型mAb標(biāo)記的AuNP載體做對(duì)照，同時(shí)使用傳統(tǒng)Lipofectamine2000載體做比較，將SLFN11基因?qū)際CT8細(xì)胞。用熒光顯微鏡觀察不同載體介導(dǎo)的SLFN11基因轉(zhuǎn)化率，用Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的SLFN11蛋白表達(dá)水平。
　　(4)選取CPT-11的活性代謝產(chǎn)物SN-38對(duì)細(xì)胞株干預(yù)24h或48h。MTT法檢測(cè)SLFN11siRNA干預(yù)或過(guò)表達(dá)對(duì)SN-3

6、8抑制人腸癌細(xì)胞生存率的影響。
　　(5) PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SLFN11基因表達(dá)水平對(duì)SN-38誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率的影響。
　　(6)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SLFN11基因表達(dá)水平對(duì)SN-38誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的影響。
　　結(jié)果:
　　(1) SLFN11基因在八種腸癌細(xì)胞株中存在差異性表達(dá)，該基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平表現(xiàn)為一致。SLFN11在HCT8、HCT116細(xì)胞株中表達(dá)水平較低，而在LS174T、SW480

7、細(xì)胞株中則表達(dá)水平較高。
　　(2) SLFN11 siRNA有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，與Contol siRNA組相比，SLFN11基因蛋白表達(dá)水平減低50-81％。重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-SLFN11測(cè)序正確。EXN91 mAb標(biāo)記的AuNP載體可將SLFN11基因?qū)?0％以上的HCT8細(xì)胞，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Lipofectamine2000載體對(duì)SLFN11基因的細(xì)胞導(dǎo)入(10％)。而同型對(duì)照mAb標(biāo)記的AuNP載體只有極少量的SLF

8、N11基因?qū)?。?jīng)典的Lipofectamine2000載體僅能使HCT-8細(xì)胞中SLFN11的蛋白表達(dá)水平上調(diào)2.1倍，而EXN91-mAb-AuNP靶向輸送系統(tǒng)則可使HCT-8細(xì)胞中SLFN11蛋白表達(dá)水平上調(diào)11.9倍。
　　(3)不同濃度SN-38作用腸癌細(xì)胞株48h，LS174T和SW480細(xì)胞株siRNA干擾組較陰性干擾對(duì)照組(mock)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯減低(p＜0.01，0.01)。SLFN11低表達(dá)的HCT8和

9、HCT116細(xì)胞株siRNA干擾組較陰性干擾對(duì)照組，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率無(wú)顯著性減低(p＞0.05)。EXN91mAb-AuNP介導(dǎo)的HCT8細(xì)胞SLFN11基因表達(dá)上調(diào)后，與對(duì)照組相比，明顯增強(qiáng)SN-38對(duì)細(xì)胞增殖的抑制(p＜0.001)。
　　(4)80nM SN-38作用24h，可誘發(fā)腸癌細(xì)胞株發(fā)生細(xì)胞S期早期阻滯，與不用藥物空白對(duì)照組相比， G0/G1期細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞明顯減少(p＜0.01)。SN-38干預(yù)LS174T和

10、SW480細(xì)胞株中，SLFN11基因siRNA干預(yù)均可以明顯減少細(xì)胞周期S早期阻滯的比例:與mock+SN-38組相比:LS174T和SW480細(xì)胞株SLFN11siRNA+SN-38組G0/G1期細(xì)胞減少(p＜0.05，p＜0.05)S期細(xì)胞增多(p＜0.01，p＞0.05)。HCT8細(xì)胞株進(jìn)行EXN91mAb-AuNP介導(dǎo)的SLFN11基因表達(dá)上調(diào)后，也出現(xiàn)明顯的G1期阻滯，G0/G1期細(xì)胞比例較對(duì)同型mAb照組及空白對(duì)照明顯升高，

11、S期細(xì)胞減少（p均＜0.01）。Lipofectamine2000介導(dǎo)的SLFN11基因表達(dá)上調(diào)后，G0/G1期細(xì)胞比例輕度升高，但較空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　(5) SN-38可以誘發(fā)腸癌細(xì)胞株凋亡（對(duì)照+SN-38組vs空白對(duì)照組，p＜0.001）。與mock SN-38干預(yù)組相比，SLFN11基因siRNA干預(yù)可以明顯減少LS174T和SW480株用藥組細(xì)胞凋亡比例(p＜0.05，p＜0.05)。HCT8

12、細(xì)胞株進(jìn)行EXN91 mAb-AuNP介導(dǎo)的SLFN11基因表達(dá)上調(diào)后，與同型mAb-AuNP對(duì)照組相比，SN-38誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡比例明顯增加(p＜0.01)。Lipofectamine2000-SLFN11組較control組，細(xì)胞凋亡也有所增加(p＜0.05)。
　　(6) SLFN11基因能增強(qiáng)SN-38對(duì)細(xì)胞的作用，在沒(méi)有SN-38干預(yù)的條件下，SLFN11基因表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡都無(wú)影響(p＞0.05)。

13、　　結(jié)論:
　　(1)在人源性結(jié)直腸癌細(xì)胞株中，SLFN11基因表達(dá)水平存在明顯差異，在LS174T、SW480細(xì)胞株中高表達(dá)，在HCT8和HCT116細(xì)胞株中低表達(dá)。
　　(2) SLFN11基因表達(dá)水平影響SN-38對(duì)腸癌細(xì)胞的作用。我們?cè)谀c癌細(xì)胞株中證實(shí)SLFN11表達(dá)下調(diào)會(huì)減低細(xì)胞對(duì)SN-38的敏感性;上調(diào)SLFN11表達(dá)可以增強(qiáng)SN-38對(duì)腸癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制、細(xì)胞周期G1期阻滯和細(xì)胞凋亡。
　　(3)我們首